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非特指型外周T细胞淋巴瘤中FGR和TP73蛋白表达及其基因改变的研究

作　者: 王艳茹
导　师: 张建中
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 外周T细胞淋巴瘤,非特指型 FGR TP73 免疫组织化学荧光原位杂交
分类号: R733.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景和目的非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL-NOS)是一组来源于成熟T细胞的高侵袭性肿瘤,预后差,五年生存率仅20~30%。发病有明显地域和种族差异,我国及亚洲其他国家较西方国家高发。目前,该肿瘤发病机制不明,可能与EBV和HTLV-1感染有关。本课题组前期研究应用1Mb a-CGH技术对31例PTCL-NOS进行了染色体改变的分析,发现9例在1p36.32-p36.11区段改变最为明显,且与患者的不良预后显著相关,其中8例频发性获得,1例缺失。分别位于1p36.11和1p36.32位点的FGR和TP73均为肿瘤相关基因,且都参与淋巴造血系统肿瘤的发生发展,但其在PTCL-NOS中的作用尚未见文献报道。我们拟从蛋白和基因两个水平研究FGR和TP73在PTCL-NOS中的可能作用,以验证前期研究发现,并探讨它们在PTCL-NOS发生发展中的分子机制,为该肿瘤的病理诊断和预后评估提供科学依据。方法应用免疫组织化学技术和间期荧光原位杂交技术分别从蛋白和基因两个水平对其进行研究。具体步骤如下:1.标本收集:收集山西肿瘤医院、304医院、307医院和306医院病理科2001年10月-2010年10月临床病理活检中PTCL-NOS甲醛固定石蜡包埋组织标本34例(其中19例在前期研究中进行了1Mb a-CGH的检测)。10例扁桃体和反应性淋巴组织增生作为对照。2.免疫组织化学技术:采用EnVision二步法,检测FGR和TP73在PTCL-NOS组织中的表达情况。实验步骤按说明书进行,每次实验均设置阳性对照和空白对照。3.探针制备(1) BAC DNA:FGR基因RP1-159A19 (1p36.13)和TP73基因RP5-1092A11 (1p36.2~36.33),由英国剑桥大学刘宏祥教授惠赠。DNA提取过程为:BAC克隆过夜培养后,Qiagen’s Qiaprep Miniprep kit提取细菌中的质粒并纯化,然后用紫外分光光度计(NanoDrop)检测DNA的浓度,浓度约为15 ng/μl。(2) TempliPhi扩增环状BAC DNA:因缺口平移法标记探针需DNA为1μg,故先使用TempliPhi扩增试剂盒(美国GE Healthcare公司)对BAC DNA进行高效特异扩增,使BAC DNA的浓度达到200~800 ng/μl,以备荧光标记所需。(3)探针标记:应用缺口平移试剂盒(Nick Translation Kit,美国Abbott Molecular-Vysis公司)进行探针标记。因购买的1号染色体着丝粒(CEP1)探针为罗丹明红色荧光标记,故对BAC DNA进行FITC绿色荧光标记,以示对照。(4)探针沉淀:标记探针中含有未反应底物以及有机或无机离子,故需对探针进行纯化;又因BAC DNA中包含很多DNA重复序列,故加入人COT-1 DNA与制备探针共沉淀,以阻断FISH检测过程中的非特异性杂交。基本步骤为标记好的探针溶液中加入人COT-1 DNA、3M醋酸钠和无水酒精低温共沉淀,离心后70%酒精洗涤,低温沉淀后再次离心,最后用LSI/WCP杂交缓冲液(Abbott Molecular Vysis)重悬,4℃冰箱中保存。4.间期荧光原位杂交:自制特异位点探针与1号染色体着丝粒探针(作为对照)混合,进行间期双色荧光原位杂交,扁桃体组织作为对照。5.统计学分析:应用SPSS 17.0统计软件包,采用Kaplan-Meier法对病例随访资料进行生存分析,log-rank检验进行两组生存率差异的比较,Fisher’s精确检验进行两种因素之间的相关性分析,P<0.05有统计学意义。结果1.临床病理学特点34例PTCL-NOS患者中,男性23例,女性11例,男女之比2.1:1,中位年龄51岁(6~83岁);20例发生于淋巴结,12例发生于结外组织,余2例发生部位不明。12例获得临床分期者,2例为Ⅰ级,2例为Ⅱ级,5例为Ⅲ级,3例为Ⅳ级,余临床分期不明。仅18例(52.9%)获得临床随访资料,中位随访时间为11.8个月(2~72个月),其中15例死亡,3例生存,余失访。在组织病理学上,正常组织结构破坏,弥漫性肿瘤细胞浸润。组成肿瘤细胞中等大小或体积较大,核形不规则,核深染或泡状核,核仁明显,核分裂多见。个别病例细胞较小,核异型性明显,可见透明细胞或R-S样细胞。肿瘤间质中高内皮小静脉增多。2. FGR和TP73蛋白表达(1) FGR蛋白表达:PTCL-NOS肿瘤细胞部分表达FGR蛋白,阳性产物主要位于细胞质和/或细胞核。本组34例中有11例表现为不同程度的FGR阳性,阳性表达率为32.4%。此外,肿瘤间质和反应性淋巴组织中浸润的炎细胞(主要为粒细胞和组织细胞)亦表达FGR蛋白。(2) TP73蛋白表达:TP73蛋白阳性产物位于细胞质,34例PTCL-NOS中TP73表达阳性仅5例,阳性表达率为14.7%,且为弱阳性。扁桃体及反应性淋巴组织中未见TP73表达。3. FGR和TP73基因改变34例PTCL-NOS中出现基因改变者7例(20.6%),其中FGR扩增1例,TP73扩增2例;FGR和TP73同时出现基因改变4例(11.8%),其中同时杂合性缺失(LOH)1例,同时扩增3例。CEP1拷贝数增加4例(11.8%),与TP73/FGR基因扩增同时存在。扁桃体及反应性淋巴组织中未见两种基因改变。4. FGR和TP73改变的临床意义应用Kaplan-Meier生存分析显示:TP73蛋白表达阳性组较阴性组预后差(P<0.05);FGR蛋白表达阳性组的预后与FGR阴性组相比较无显著性差异(P>0.05);FGR/TP73/CEP1改变组较无FGR/TP73/CEP1改变组以及TP73改变组较TP73无改变组有预后不良的趋势,但log-rank检验无显著性差异(P>0.05);FGR改变组与FGR无改变组、FGR扩增组与FGR无扩增组、TP73扩增组与TP73无扩增组以及CEP1拷贝数增加组与CEP1无拷贝数增加组总生存期比较均无统计学意义。Fisher’s精确检验进行两种因素之间的相关性分析显示:TP73蛋白表达与基因改变、TP73改变以及TP73扩增显著相关(P值分别为0.048、0.029和0.015);各种基因改变及蛋白表达情况与性别、年龄、发生部位均无相关性。结论1.应用TempliPhi法扩增从细菌中提取的BAC DNA,缺口平移法对扩增后的BAC DNA进行荧光标记,制得所需的特异位点探针,然后进行荧光原位杂交,可检测淋巴瘤石蜡组织中特异基因的改变。2. SRC家族成员FGR是EBV相关基因,在PTCL-NOS的发生发展过程中可能起着重要的作用。TP53抑癌基因家族成员TP73在PTCL-NOS中过表达提示患者预后差,TP73的异构体DeltaNp73在其中可能发挥着一定的作用。TP73基因扩增可能是PTCL-NOS患者预后差的一个重要因素,但TP73在PTCL-NOS中的作用机制有待于进一步研究证实。3. 1p36.32-36.13区段的异常可能为PTCL-NOS的染色体特异改变,对该病的诊断和预后评估可能有一定意义。1号染色体多体可能在PTCL-NOS发生发展中起着某种作用。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-15
前言  15-17
材料与方法  17-28
  1. 临床病例收集  17
  2. 免疫组化染色  17-19
  3. 探针制备  19-24
  4. 荧光原位杂交  24-26
  5. 结果判定  26-27
  6. 统计学分析  27-28
结果  28-40
  1. 临床特点  28
  2. 病理学改变和免疫表型  28-29
  3.FGR 和TP73 蛋白表达  29-32
  4.BAC DNA 扩增  32
  5. 分子遗传学改变  32-37
  6.FGR 和TP73 改变的临床意义  37-40
讨论  40-46
结论  46
未来研究展望  46-47
参考文献  47-53
文献综述(一)  53-61
  参考文献  57-61
文献综述(二)  61-79
  参考文献  72-79
文献综述(三)  79-83
个人简历  83-84
致谢  84-85

非特指型外周T细胞淋巴瘤中FGR和TP73蛋白表达及其基因改变的研究

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