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天然小分子化合物FTC诱导髓系白血病细胞分化的作用靶点发现与确证研究

作　者: 孙文峰
导　师: 从玉文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 天然小分子化合物 FTC PKC激动剂抑癌剂白血病诱导分化治疗白血病 PKC/ERK通路艾滋病 prostratin
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

白血病严重危害着人类的健康。传统的放化疗手段对处于增殖状态的正常细胞亦具有杀伤效应,因而导致骨髓抑制、消化道反应、脱发、肝肾损害等严重的不良反应。诱导分化治疗是白血病治疗的新方向。现有的白血病细胞诱导分化剂多数还停留在实验研究阶段。除ATRA,国内外还没有新型诱导分化剂进入白血病的临床治疗。天然小分子化合物FTC是从早禾树的枝叶中分离获得的一类二萜类化合物。本课题研究结果表明FTC诱导白血病细胞分化活性高,具有如下特点:①诱导分化活性强:优于ATRA,与PKC激动剂PMA相近;②适应症广:对包括APL在内的多种急、慢性髓系白血病以及淋巴细胞白血病均具有诱导分化作用;③有效剂量范围宽:FTC的有效剂量与ATRA相当,高于PMA,但与PMA不同的是,FTC诱导白血病细胞分化具有良好的剂量效应;④在诱导分化的剂量范围内,可抑制白血病细胞增殖,显著降低其成瘤性;⑤与ATRA存在协同诱导白血病分化作用,可以联合用药。我们还发现PKC特异性抑制剂可完全逆转FTC的诱导分化活性,并可呈时间剂量依赖性地引起细胞内ERK磷酸化,并能被PKC特异性抑制剂所阻断。这说明了FTC诱导白血病细胞分化是通过PKC/ERK信号通路作用的。PKC是依赖钙、磷脂和DAG激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的多基因超家族,为信号转导中的关键部分,包含12个以上的亚型,主要可分为三大类:传统型PKC:包括α、βⅠ、βⅡ及γ,依赖钙、磷脂、DAG或佛波酯激活;新型PKC:包括δ、ε、η及θ等亚型,依赖磷脂、DAG或佛波酯,但不依赖钙激活;非典型PKC:包括λ、ξ及ι等,仅需要磷脂而不依赖钙、DAG或佛波酯。PKC为一条单链多肽,该多肽链氨基端序列为调节域,羧基端序列为催化域,两者之间通过可被蛋白酶水解的“铰链区”连接,该区在酶的激活过程中发生降解,从而使PKC活性部位暴露。调节域主要含有C1、C2两个区,其中C1区为DAG及佛波酯的结合位点。PMA是一种最常用的佛波酯。PMA可以同PKC的C1区结合,并模拟DAG的作用激活PKC。从化学结构上看,FTC具有和PMA相类似的母核结构,并且具有和PMA类似的插入磷脂分子层的脂肪链。我们采用FTC与放射性配体[3H]PDBu竞争性结合PKC实验来探讨FTC同PKC体外结合。结果显示:FTC可以完全抑制[3H]PDBu与PKC家族蛋白的特异性结合,并呈明显的剂量效应关系。计算出FTC同PKC传统型、新型亚型及PKD1结合的Ki值。FTC对传统型PKC亲和力高于新型PKC,同PKD结合力相对较低。从相似的化学结构和较高的亲和力,可以推断FTC与PDBu是作用于PKC家族蛋白相同部位的且其亲和力较高。PKC是G蛋白偶联受体系统中的效应物,在非活性状态下是水溶性的,游离存在于胞质溶胶中,激活后成为膜结合的酶。PKC的激活是依赖磷脂、DAG和Ca2+。当DAG在质膜中出现时,胞质溶胶中的PKC被结合到质膜上,然后在Ca2+的作用下被激活。PMA可在很低的浓度下模拟DAG,激活PKC。利用γ-32P标记的ATP可通过测定其催化的组蛋白Ⅲ-s上具有放射活性的32P来测定PKC酶活性。结果表明,反应体系中存在不同浓度的FTC时,组蛋白磷酸化水平提高,并呈明显的剂量效应关系。实验结果显示,FTC是PKC蛋白的激动剂,对传统型和新型PKC蛋白的激动没有明显差异,不能激活PKD。共聚焦显微镜下可以直接观察到FTC可以在30min内使细胞内过表达PKC- EGFP发生膜转位。分别提取FTC处理前后的K562细胞的细胞质、细胞膜,western blot检测蛋白组分,证明了FTC对PKCα的膜转位作用。有研究表明,PKC上佛波酯受体激动剂可能具有促癌活性,而拮抗剂有可能是抑癌物质。PMA是典型的PKC激动剂。在小鼠皮肤上少次数涂抹PMA,可使小鼠皮肤产生急性炎症,表现为红肿和水肿,并出现表皮增生。长期多次涂抹PMA,可以诱发小鼠皮肤乳头状瘤的发生进而实现化学致癌的发生发展。这表明PMA为一种促癌剂。皮肤组织受促癌剂作用后最明显反应之一是急性炎症反应和表皮增生。急性炎症和表皮增生发生的越早、程度越剧烈、持续的时间越长均预示着促癌作用越强。阻断或抑制促癌过程,可以达到预防肿瘤发生的目的。而急性炎症和表皮增生的程度与促癌活性的作用密切相关,因此,阻断或拮抗急性炎症及表皮增生,是判断化合物抑癌作用的重要指标。我们通过小鼠皮肤急性致炎和表皮增生实验来判断FTC是否具有潜在致癌活性及其是否具有抑癌作用。结果表明,同PMA相比,PMA 200倍剂量的FTC亦未见明显的致表皮增生作用。FTC还可以拮抗PMA引起的表皮增生作用,第二次给药的剂量越大,首次给药在相对较小的剂量下就可以取得较好的拮抗效果。涂抹5μg PMA 12h后取皮肤,肉眼可见皮肤组织肿胀,颜色苍白而柔软,切面呈胶冻状,水肿明显。而涂抹FTC小鼠皮肤未见水肿样改变。以小鼠皮肤含水量/皮肤干重作图,可见同对照组相比,PMA组小鼠皮肤明显水肿,而FTC组与对照组相当,并且在能够拮抗小鼠表皮增生的有效剂量范围内,FTC可以有效的拮抗PMA引起的小鼠皮肤水肿。对小鼠耳廓涂抹PMA后3h,可观察到小鼠耳廓变红,变厚,血管充盈,耳轮和耳屏呈红肿状,而FTC组及拮抗组仅表现为耳廓轻微充血。在6h后,FTC组和拮抗组就出现了明显的恢复,同DMSO组相比没有明显的区别,而PMA组在24h后也未出现恢复,血管充盈明显,耳屏和耳轮红肿程度并未减轻。这一结果说明,FTC引起的耳部炎症作用轻微、持续时间短,PMA引起的耳部炎症作用时间长、程度严重,并且FTC可以拮抗PMA对小鼠耳部致炎作用。从我们现有的研究结果看,FTC可明显抑制PMA所引起的表皮增生,并从皮肤水肿、耳红肿等方面明显抑制PMA所引起的急性炎症,显示了其具有良好的抗始发突变活性。预示着FTC没有致癌活性,并且可以阻断PMA致癌作用的发生发展。Prostratin是一种PKC激动剂,可协助艾滋病治疗。通过检测molt-4细胞系CD4/CXCR4表面标志,证明了FTC可时间剂量依赖性的降低CD4/CXCR4阳性细胞比例,并且使CXCR4降低的有效剂量低于使CD4降低的有效剂量。实验结果显示,PKC的新型激动剂prostratin在对髓系白血病细胞的诱导分化作用方面,表现出了同FTC相似的作用与机制。提示prostratin可作为白血病诱导分化剂发挥新的用途。总之,天然小分子化合物FTC是一类新型的PKC激动剂,其通过激活PKC/ERK通路诱导白血病细胞分化,其还可能在协助艾滋病的治疗中发挥作用。并且FTC是一种潜在的抑癌剂,具有巨大的新药研发价值,并且为PKC功能研究提供了新型的小分子探针。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-14
第一部分天然小分子化合物 FTC 诱导分化治疗白血病的作用及其初步机制研究  14-31
  第一节 FTC 对多种人白血病细胞诱导分化作用研究  15-24
  第二节 FTC 诱导白血病细胞分化的初步机制研究  24-29
  讨论  29-31
第二部分 FTC 作用靶点的发现与确证  31-49
  第一节 FTC 同[~3H] PDBu 竞争性结合蛋白激酶C  31-41
  第二节 FTC 对PKC 酶活性的影响  41-43
  第三节 FTC 在细胞水平对PKC 膜转位的影响  43-48
  讨论  48-49
第三部分 FTC 拮抗PMA 诱导CD-1(ICR)小鼠皮肤表皮增生和急性致炎作用的研究  49-61
  第一节 FTC、PMA 诱导CD-1(ICR)小鼠表皮增生作用的研究  50-52
  第二节 FTC 拮抗PMA 诱导CD-1(ICR)小鼠表皮增生作用的研究  52-55
  第三节 FTC 拮抗PMA 引起CD-1(ICR)小鼠皮肤水肿作用的研究  55-57
  第四节 FTC 拮抗PMA 引起CD-1(ICR)小鼠耳红肿作用的研究  57-59
  讨论  59-61
第四部分 FTC 对molt-4 细胞表面的HIV 受体和辅助受体作用的研究  61-65
  实验材料与方法  61-62
  实验结果  62-64
  讨论  64-65
第五部分 PKC 激动剂Prostratin 诱导急性髓系白血病细胞分化的作用及其初步机制研究  65-70
  实验材料与方法  65
  实验结果  65-69
  讨论  69-70
全文讨论  70-74
结论  74-75
参考文献  75-79
所用溶液配制  79-82
文献综述  82-88
  参考文献  85-88
文章发表情况  88-108
个人简历  108-109
致谢  109

天然小分子化合物FTC诱导髓系白血病细胞分化的作用靶点发现与确证研究

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