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Let-7b在心脏中的功能研究

作　者: 曹阳
导　师: 杨晓
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 心脏微RNA Let-7b 转基因小鼠心肌细胞
分类号: R541
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

心脏是哺乳动物在胚胎发育时期最早形成的器官，也是机体最保守的器官之一，心血管系统的正常发育及功能维持受到精确的调控。近年来，心血管疾病已成为危害人类生命的首要因素之一。因此，对心血管系统的发育、生理以及病理机制的研究成为生命科学研究的热点问题。微RNA(miRNAs)是一类18～25个碱基组成的，在进化上高度保守的单链非编码小RNA，是由具有70-90bp的前体经Dicer酶剪切形成的。miRNAs主要通过碱基互补配对原则结合于靶基因的3’非翻译区（3’-UTR），通过调节mRNA的稳定性或抑制翻译从而调节靶基因的表达。近年来的研究表明nljRNAs在心脏发育与疾病过程中部发挥了重要功能。Let-7是最先在线虫中被发现的一类miRN A．”，其生物学功能十分广泛，在细胞的增殖与分化及肿瘤发生的过程中部发挥了非常重要的功能。对人类心脏疾病和各种心肌肥厚动物模型的标本进行差异表达miRNAs筛选时发现Let-7b在这些病理标本中表达水平明显升高，提示其在心脏疾病发生过程中可能发挥了一定的作用，但目前关于其在心脏组织发挥的具体功能尚未见报道。本研究的目的是研究Let-7b在心脏组织中的功能。我们首先在体外研究了Let-7b对心肌细胞生物学特性的影响。构建了过表达Let-7b的重组腺病毒载体，通过转染Ad293细胞包装了用于过表达Let-7b的腺病毒(AdV—Let-7b)。为了验证该病毒的有效性，我们利用AdV—Let-7b感染了原代心肌细胞，同时以感染AdV—GFP为对照，24小时后，收集细胞提取RNA进行rolRNl,A No 11em B10t的检测，结果显示AdV—Let-7b感染心肌细胞后Let-7b表达水平明显升高，表明AdV—Let-7b能有效地过表达Let-7b。利用AdV-GFP和AdV-Let-7b腺病毒感染原代心肌细胞24小时后，加或不加100uM苯肾上腺素(PE)继续处理24小时后，利用心肌细胞特异性抗体(a-acti n)进行免疫荧光染色，观察心肌细胞尺寸的变化。使用200×放大倍数，在显微镜下随机选取20个视野拍照。使用Spot AdVanced(1图像分忻软件统计心肌细胞面积，每组至少统计150个细胞。结果表明心肌细胞过表达Let-7b促进了心肌细胞尺寸的增加。我们又分忻了Let-7b过表达对心肌细胞增殖和凋亡情况的影响。利用腺病毒感染心肌细胞48小时后，收集细胞，通过流式细胞术分忻各周期细胞所占比例，结果显示Let-7b过表达后对原代心肌细胞的细胞周期没有明显改变。通过AmlexinV检测心肌细胞的凋亡情况，发现Let-7b过表达的原代心肌细胞中凋亡细胞所占比例降低，提示Let-7b对于原代心肌细胞的凋亡有抑制作用。为了寻找Let-7b作用的靶分子，我们利用GrgetScall预测了Let-7b可能的靶分子，从中挑选与心肌肥厚和凋亡相关的分子，如C{lspase3，Mapk6，Ignr，Igf2bp2进行验证，分忻显示这些基因的3’-UTR区域与Let-7b成熟序列的种子区有良好的匹配，nlciferase实验显示过表达Let-7b可明显降低Caspase3，Mapk6和[gf2bp2的3’-UTR活性，提示这些基因有可能是Let-7b作用的靶分子。为了研究Let-7b在体内的功能，我们选用a—MHC基因启动子，构建了在心肌细胞特异性过表达Let-7b的转基因载体，通过显微注射获得了心肌细胞特异性过表达Let-7b的转基因小鼠。利用Real-time PCR和NortheTn Blot对子代小鼠心脏组织中Let-7b表达水平进行检测发现，转基因小鼠心脏组织中Let-7b表达水平明显升高，说明成功地建立了心肌细胞特异性过表达Let-7b的转基因小鼠。对转基因小鼠进行了初步的表型分忻。选取二月龄雄性的转基因和野生型对照小鼠，分别测量其体重(BW)、心脏重量(Hw)以及胫骨长度(TL)。统计分忻发现，与对照小鼠相比，心肌细胞特异性过表达Let-7b转基因小鼠的Hw／BW和Hw／TL比值有增加的趋势，但无统计学显著性差异。对小鼠心脏组织进行H&E染色观察心脏组织学结构，发现二月龄转基因小鼠心肌排列正常，心室无明显扩张，室壁厚度略有增加。利用lasson染色观察心脏纤维化情况，发现二月龄转基因小鼠未发生明显的心肌纤维化。利用vev0770超声系统(visual So]Rl CS Inc，加拿大)对Let-7b的转基因小鼠进行心脏功能的检测，发现与对照小鼠相比，2月龄Let-7b的转基因小鼠左心室后壁舒张末期厚度(LVPWd)，左心室后壁收缩末期厚度(LvPWs)及左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd)均有增加，左心室收缩末期内径(LvIDs)减小，且以上指标均有统计学差异，提示Let-7b在心脏组织过表达使转基因小鼠室壁增厚。对转基因小鼠心脏组织中的分子改变进行检测，发现肥大标志基因，如B-MHC，ANF和BNP，在转基因小鼠心脏组织中明显上调，而Dicer的表达水平明显下调。本研究在国际上首次研究了Let-7b在心脏组织中的功能，体外实验显示Let-7b过表达促进了心肌细胞尺寸的增加，对心肌细胞的增殖无明显影响，对心肌细胞的凋亡有抑制作用。此外，我们成功建立了心肌细胞特异性过表达Let-7b转基因小鼠，进行了初步的表型分忻，发现二月龄Let-7b转基因小鼠与对照小鼠相比，虽然大体形态上无显著差异，但组织学显示心室壁增厚，超声检测结果显示转基因小鼠心室壁厚度增加，肥大标志基因表达水平上调，提示Let-7b在体内过表达有发生心肌肥厚的趋势，在某些压力性负荷刺激下可能更容易发生心肌肥厚。我们的实验结果为理解Let-7b在心脏组织中的功能提供了一定的理论基础，心肌细胞特异性过表达Let-7b转基因小鼠的成功建立也有可能为了解人类心脏疾病发生机制，发展心血管疾病的治疗策略提供理想的实验动物模型。

全文目录

缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
第1章前言  13-23
  1 心脏发育与心脏疾病  13-15
    1.1 心脏发育  13-14
    1.2 心脏疾病  14-15
  2 miRNA简介  15-18
    2.1 miRNA的生物发生  15-16
    2.2 miRNA调节靶基因的作用机制及研究方法  16-18
  3 miRNA在心脏发育与疾病中的研究进展  18-20
    3.1 miRNA在心脏发育中的研究  18-19
    3.2 miRNA在心脏疾病中的功能  19-20
  4 Let-7b功能的研究进展  20-21
  5 拟解决的科学问题及意义  21-23
第2章材料与方法  23-35
  2.1 主要材料  23-24
    2.1.1 质粒  23
    2.1.2 细胞  23
    2.1.3 引物  23
    2.1.4 工具酶和试剂  23-24
    2.1.5 实验动物  24
  2.2 实验方法  24-35
    2.2.1 腺病毒的保存与扩增  24
    2.2.2 大鼠原代心肌细胞分离、培养及心肌细胞面积统计  24-26
    2.2.3 流式细胞术检测大鼠原代心肌细胞生长周期  26
    2.2.4 流式细胞术检测大鼠原代心肌细胞凋亡  26
    2.2.5 细胞及组织中总RNA的提取  26-27
    2.2.6 逆转录反应  27
    2.2.7 Real-time PCR  27-28
    2.2.8 miRNA的Northern杂交  28-30
    2.2.9 α-MHC-Let-7b转基因载体的构建  30
    2.2.10 转基因小鼠的基因型鉴定  30-31
    2.2.11 石蜡包埋和切片  31
    2.2.12 H&E染色  31-32
    2.2.13 Masson染色  32
    2.2.14 细胞转染  32-33
    2.2.15 荧光素酶报告基因活性分析实验(Luciferase)  33
    2.2.16 小鼠心脏的超声检测  33-35
第3章实验结果  35-45
  3.1 心肌细胞内过表达Let-7b促进心肌细胞尺寸增大  35-36
  3.2 Let-7b对大鼠原代心肌细胞周期无明显影响  36
  3.3 Let-7b抑制大鼠原代心肌细胞凋亡  36-37
  3.4 Let-7b可能的靶分子检测  37-38
  3.5 心肌细胞特异性过表j~Let-7b转基因载体(α-MHC-Let-7b)的构建  38-39
  3.6 α-MHC-Let-7b转基因首建者小鼠的建立  39-40
  3.7 α-MHC-Let-7b转基因小鼠心脏组织中Let-7b表达水平的检测  40
  3.8 α-MHC-Let-7b转基因小鼠心脏大体形态无显著改变  40-41
  3.9 α-MHC-Let-7b转基因小鼠组织学的分析  41-42
  3.10 心肌细胞特异性Let-7b转基因小鼠心脏功能的检测  42-43
  3.11 Let-7b转基因小鼠心脏组织中肥大标志因子表达水平上升，Dicer表达水平下降  43-45
第4章讨论  45-47
第5章结论  47-49
参考文献  49-53
文献综述  53-59
  参考文献  57-59
在读期间发表论文  59-65
个人简历  65-67
致谢  67

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