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白念珠菌CaFOL1和CaFOL2基因功能的鉴定

作　者: 郭睿
导　师: 蒋伶活
学　校: 天津大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 白念珠菌 CaFOL1 CaFOL2 URA-BLASTER
分类号: R519
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 13次
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内容摘要

叶酸在体内可以转变为四氢叶酸，充当一碳单位转移酶系统中的辅酶，从而参与蛋氨酸的合成，嘌呤的合成以及胸腺嘧啶核苷酸的合成等生物途径。白念珠菌是一种重要的条件致病真菌。白念珠菌CaFOL1和CaFOL2基因的ORF全长分别是2367bp和831bp，分别编码含有788个氨基酸残基和276个氨基酸残基的蛋白质。为了研究CaFOL1和CaFOL2是否在体内四氢叶酸合成途径中发挥重要作用，我们使用URA-BLASTER技术构建了白念珠菌CaFOL1和CaFOL2基因的单等位基因缺失株和双等位基因缺失株。表型分析表明白念珠菌CaFOL2双等位基因缺失株（fol2△/fol2△）在不添加外源叶酸时不能存活。我们将白念珠菌CaFOL2基因克隆到白念珠菌表达载体pCR4上，把构建的pCR4-CaFOL2质粒转化到CaFOL2的双等位基因缺失株中。含有pCR4-CaFOL2质粒的缺失株能够在不添加外源叶酸的环境下生长。这些结果表明CaFOL2基因是白念珠菌四氢叶酸合成所需要的。然而，我们发现即使在外界补充叶酸的情况下，我们无法得到CaFOL1双等位基因缺失株，表明CaFOL1双等位基因缺失株在外界补充叶酸的情况下也可能不能生长。因此，我们推测CaFOL1是白念珠菌生长的必须基因。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
目录  5-7
第一章文献综述  7-10
  1.1 白念珠菌简介  7-8
  1.2 白念珠菌 CaFOL1 和 CaFOL2 基因研究背景  8-10
第二章实验材料和方法  10-23
  2.1 实验材料  10-16
    2.1.1 菌株  10
    2.1.2 质粒  10-11
    2.1.3 引物  11-12
    2.1.4 培养基  12-13
    2.1.5 试剂  13-14
    2.1.6 常用溶液与缓冲液  14-15
    2.1.7 主要仪器  15-16
  2.2 试验方法  16-23
    2.2.1 大肠杆菌和白色念珠菌菌株的培养与保存  16
    2.2.2 CaCl_2法制备感受态细胞  16
    2.2.3 碱裂解法小量快速制备质粒DNA  16-17
    2.2.4 玻璃珠法提取白色念珠菌基因组DNA  17
    2.2.5 PCR扩增DNA片段  17-18
    2.2.6 质粒DNA的酶切与连接  18-19
    2.2.7 乙醇沉淀法纯化DNA片段  19
    2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的转化  19-20
    2.2.9 乙酸锂法转化白念珠菌细胞  20
    2.2.10 DNA片段的切胶回收  20
    2.2.11 大肠杆菌菌落PCR  20-21
    2.2.12 白念珠菌基因的敲除方法  21
    2.2.13 生物信息学方法  21-23
第三章实验结果及讨论  23-49
  3.1 引言  23
  3.2 白念珠菌CaFOL1 基因的敲除  23-33
    3.2.1 CaFOL1 基因敲除盒的构建策略  23-24
    3.2.2 CaFOL1 基因的敲除策略  24-25
    3.2.3 CaFOL1 基因的敲除盒的构建  25-30
    3.2.4 CaFOL1 基因的敲除  30-33
      3.2.4.1 CaFOL1 单等位基因的敲除  30-32
      3.2.4.2 CaFOL1 双等位基因的敲除  32-33
  3.3 白念珠菌CaFOL2 基因的敲除  33-45
    3.3.1 CaFOL2 基因敲除盒的构建策略  33-34
    3.3.2 CaFOL2 基因的敲除策略  34-35
    3.3.3 CaFOL2 基因的敲除盒的构建  35-40
    3.3.4 CaFOL2 基因的敲除  40-45
      3.3.4.1 CaFOL2 单等位基因的敲除  40-42
      3.3.4.2 CaFOL2 双等位基因的敲除  42-45
  3.4 白念珠菌CaFOL2 基因的克隆  45-47
  3.5 白念珠菌CaFOL2 基因的功能鉴定  47-48
  3.6 总结与讨论  48-49
参考文献  49-51
发表论文情况说明  51-52
致谢  52

白念珠菌CaFOL1和CaFOL2基因功能的鉴定

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