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云南省HIV-1流行毒株及HIV早期感染病毒准种的基因变异和分子进化研究

作　者: 刘永健
导　师: 李敬云
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 人免疫缺陷病毒近似全长基因组分子进化单基因组扩增法
分类号: R512.91
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:HIV在全球经历了复杂的起源和流行过程,HIV-1的M群已经进化为9种基因亚型、49种流行重组型（CRF）以及难以计数的独特重组型（URF）。我国流行的HIV-1毒株主要是CRF07-BC、CRF08-BC、CRF01-AE重组型以及B′亚型,并正处在疫情快速上升、多种传播途径及多种毒株共存的快速进化阶段。了解和掌握我国HIV-1毒株在人群间及个体内的变异和进化特点是艾滋病防治及研究的基础,能够为认识流行规律、设计艾滋病疫苗、研发诊断试剂及药物提供科学的依据。由于HIV-1基因的高度变异及复杂的准种,对病毒基因组扩增和测序的难度很大。以往国内外主要采用扩增和测定HIV-1基因组短片段的方法,这常常不能准确鉴定病毒的基因型及发现病毒基因的重组。在我们的课题开始前,GenBank收录的20多年间获得的中国HIV-1毒株全长基因组序列共有33条。HIV-1早期感染是其感染过程的特殊阶段,具有独特的流行病学、病毒和免疫学特征。这个时期病毒快速高水平复制、病毒血症的浓度高、传播的危险最大,约56-92%新的HIV感染是由处在这个时期的HIV感染者传播的,这个时期病毒准种的进化对病程发展和预后也有十分重要的影响。本研究建立了从血浆中扩增HIV-1全长基因组的方法和扩增测定HIV-1gp120准种序列的方法,采用建立的方法对我国艾滋病的起源和疫情最严重的云南省进行了基于全基因组序列分析的HIV-1变异和进化研究;对目前我国HIV新发感染率最高的男男同性性行为（MSM）人群进行了部分早期HIV感染者HIV-1gp120准种序列的变异和进化研究。第一部分基于全长基因组分析的云南省HIV-1毒株的基因变异和分子进化研究首先建立了5′半分子和3′半分子两段法从血浆中扩增和测定HIV-1全长基因组序列的方法。采用这个方法对云南省2009年采集的72名HIV感染者/艾滋病病人的血浆标本进行了全长基因组序列的扩增和测定,经过编辑和拼接,获得了57条HIV-1的近似全长基因序列（Near Full-Length Genome,NFLG）。基于获得的57条HIV-1近似全长基因序列和从数据库中下载的部分序列,采用MEGA、jpHMM、BEAST v 1.5.4等多个软件工具进行了云南省HIV-1流行毒株的变异和进化的研究,主要结果如下:（1）确定了云南省目前流行的主要HIV-1毒株:云南省的HIV-1流行毒株主要以CRF08_BC和CRF01_AE为主,构成比分别为45.5%和40.9%;伴随CRF07_BC和C的低度流行,构成比分别为9.1%和4.5%。描述了主要流行毒株在云南省的地区和人群分布特征。（2）发现云南省存在多种形式的HIV-1独特重组型（URF）毒株:鉴定了9株新型B′/C重组毒株,其中3株为CRF08_BC和CRF07_BC的二代重组毒株。鉴定了3株新型CRF01_AE/B/C的重组毒株,1株新型CRF01_AE/B的重组毒株。（3）分析了云南省CRF01_AE毒株与邻近地区毒株的进化关系、推断出毒株传入云南的时间和路线:证实云南的CRF01_AE毒株与比邻的广西和越南北部不存在传播关系,排除了云南省CRF01_AE毒株由广西和越南北部传入的可能,推测云南的CRF01_AE毒株是由缅甸和泰国多途径、多点传入的。根据MCC树的节点对应时间,推测进化树上的4簇CRF01_AE毒株传入云南的时间大约为1989年—1993年6月（90年代初期）。（4）推断出HIV-1C亚型毒株起源及传入中国的时间:证实C亚型毒株大约在50年代初中期（1953.8）起源于非洲,进化速率为1.86×10-3per site/per year。C亚型毒株首先传入印度,由印度传入缅甸和中国云南。通过MCC树的节点时间坐标,推断由非洲传入印度的时间大约为70年代中期（1974年）、传入缅甸和云南的时间大约为80年代早期（1982年）。（5）推断出HIV-1CRF08_BC和CRF07_BC毒株的起源时间和传播路线:CRF08_BC和CRF07_BC毒株起源时间大约为80年代中后期,进化速率为2.07×10-3per site/per year和1.83×10-3per site/per year。虽然它们起源的时间基本是一致的,但表现了在我国存在不同的传播路线。第二部分采用单基因组扩增法研究HIV-1早期感染者体内gp120准种的进化规律首先建立了单基因组扩增法（Single Genome Amplification,SGA）扩增和测定HIV-1gp120准种序列的方法,通过对多个单一模板的扩增和测序,得到来自样本中单一模板的多条序列。经检验,每个PCR反应孔的理论cDNA模板拷贝数为0.44个,说明扩增反应是特异有效的。在24份血浆样本中共获得了gp120准种序列459条,每份样本的获得的准种序列数范围为4～35条,平均为19.1±8.6条。基于获得的459条准种序列和从数据库中下载的部分序列、采用Highlighter、TreeRate、Heatmap、Mega等多个软件工具进行了HIV-1早期感染者体内gp120基因准种的变异和进化规律研究,主要结果如下:（1）确定了研究对象感染毒株的基因型:12例研究对象中有9例感染的毒株为明确的CRF01_AE亚型、1例为明确的B亚型毒株、1例为明确的CRF07_BC亚型毒株。另有1例样本感染了2个不同的亚型的毒株,分别为B亚型毒株及C和CRF01_AE嵌合的URF毒株。（2）确定了建立感染时的毒株及其数目: 12例研究对象中有9例建立感染时的毒株数目是1株病毒,剩余3例建立感染时的毒株数目是等于或者大于2株病毒。（3）分析了早期感染进程中的准种变异度及其进化规律:12例早期感染者前一个时间点核苷酸和氨基酸水平的变异度均显著低于后一时间点（P<0.05）,说明随着感染进程的发展,病毒准种在核苷酸和氨基酸水平的变异均显著增加。由1个病毒引起感染的样本进化速率均值为1.61±0.39E-05替换/每个位点/每天（5.7E-03替换/每个位点/每年）,范围为1.28-2.22 E-05替换/每个位点/每天。早期感染者前后2个时间点的gp120准种序列均发现有APOBEC蛋白导致的G→A突变,后一个时间点比前一个时间点APOBEC蛋白导致的G→A的突变位点数显著增加（P =0.03）,提示APOBEC蛋白导致的G→A的突变随感染的进程显著地累积。（4）发现了准种序列的重组并影响病毒的复制适应性:分析由2个同型CRF01_AE病毒感染的YA-106号感染者两个时间点病毒准种的构成,说明同型病毒间的重组极易在感染后很快发生,重组毒株比非重组毒株具有明显高的复制适应性,可在较短时间内占据准种的优势。分析由两个不同亚型（URF₀1C重组型和B亚型）病毒感染的YA113号感染者两个时间点病毒准种的构成,发现从第一个时间点至第二个时间点,在54天时间内两个亚型的病毒序列并无重组,且均以重组型病毒为准种的优势。这一方面说明重组病毒具有更强的复制适应性,也提示不同亚型病毒间的重组比同亚型病毒间的重组难度大、频率低。（5）阐述了准种序列糖基化位点的特点和规律:病毒准种序列糖基化位点的数目范围为22-28个/序列,平均值为24.6±1.6个/序列。多数感染者前后2个时间点的糖基化位点数目没有显著变化（P>0.05）。CRF01_AE毒株早期感染者和非早期感染者gp120区域的糖基化位点的数目没有显著差异、糖基化位点的位置也基本一致。（6）分析了准种序列的可变区及选择压力:比较CRF01_AE毒株早期感染者与非早期感染者（来自数据库）的gp120序列可变区的肽链长度,两组序列的肽链长度均无显著性差异（P>0.05）。两组序列V3区的顶端4肽均以GPGQ为主。早期感染者携带的毒株均以CCR5作为辅助受体。9例早期感染样本gp120基因的选择压力分析结果显示4例样本呈现正向选择压力特征、5例样本呈现负向选择压力特征。不同的毒株呈现不同丰度的正向选择位点,在不同的毒株中发现了一定数量的相对集中的正向选择位点分布区域。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-14
前言  14-18
  一、云南省 HIV 的流行情况  14-16
  二、感染个体内 HIV 准种的研究方法  16-17
  三、本研究的主要内容及研究目的  17-18
第一部分基于全长基因组分析的云南省HIV-1 毒株的基因变异和分子进化研究  18-64
  实验材料  18-21
  实验方法  21-28
  结果  28-60
  讨论  60-64
第二部分单基因组扩增法研究HIV-1 早期感染者体内gp120 基因准种的进化规律  64-123
  材料和方法  64-76
  结果  76-119
  讨论  119-123
结论  123-124
参考文献  124-133
文献综述  133-145
  参考文献  140-145
代表论著  145-152
个人简历  152-153
致谢  153

云南省HIV-1流行毒株及HIV早期感染病毒准种的基因变异和分子进化研究

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