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中国华东地区慢性乙型肝炎病毒感染的全基因组关联研究

作　者: 刘瑶
导　师: 沈洪兵
学　校: 南京医科大学
专　业: 流行病学与卫生统计学
关键词: 乙型肝炎病毒全基因组关联研究单核苷酸多态性
分类号: R512.62
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球重大公共卫生问题之一，目前全球约20亿人感染过HBV，我国约7-8亿人感染过HBV。免疫力正常的成人感染HBV后，超过90%可以自发清除病毒；然而低于10%的感染者会发展为慢性HBV感染，其机制不明。慢性HBV感染包括无症状携带和慢性乙型肝炎。慢性HBV感染与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生关系密切，控制HBV感染将有助于降低HCC的发病率。HBV的慢性感染率在不同种族间也有较大差异，亚裔人群HBV慢性感染率较高，亚裔后代迁移到HBV低感染率的地区，HBV慢性感染率仍然显著高于当地人，提示遗传因素可能影响慢性HBV感染的易感性。双生子和家系研究也提示慢性HBV感染的转归与遗传因素密切相关。因此，筛选具有遗传易感性的高危个体，并对其采取针对性的预防措施或治疗手段，可能会有效的控制慢性HBV感染。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorhphisms, SNPs)是人类最常见的遗传变异，是指在人群中频率大于1%的单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)采用高通量的基因分型平台，检测大样本病例和对照的全基因组水平上的SNPs，并辅以多个独立的人群研究进行后续验证，最终得到与该疾病关联最为密切的遗传易感SNPs。2009年和2011年，日本先后开展了两个慢性乙型肝炎的GWAS，最终识别出位于HLA-DP/DQ上的SNPs与慢性乙型肝炎相关。但是这两个GWAS的对照缺乏HBV感染的暴露信息，因此所发现的SNPs与慢性乙型肝炎的强关联程度可能有混杂因素影响。2012年，日本和韩国还共同开展了慢性HBV感染的GWAS，尽管对照是明确的HBV清除者，但是初筛阶段的样本量很小，仅不足200对病例/对照，统计学把握度较低，不足以系统筛选易感SNPs。此外，这三个GWAS识别出的慢性HBV感染的易感位点都是位于HLA-DP/DQ上，仅能解释慢性HBV感染的小部分易感机制；因此有必要开展一项设计优良的大样本的GWAS，以系统研究慢性HBV感染的遗传易感机制。本研究中的病例是HBV携带者，指HBsAg阳性、HBV核心抗体(HBV coreantibody, HBcAb)阳性；对照是HBV清除者，指HBsAg阴性、HBV表面抗体(HBVsurface antibody, HBsAb)和HBcAb阳性。所有研究对象均排除丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染，即HCV抗体阴性。本研究采用的是三阶段病例对照研究设计：初筛阶段的1000例病例来自上海，包括500例HCC的HBV携带者和500例非HCC的HBV携带者；对照是来自张家港地区的983例HBV清除者。一期验证是来自苏南地区的1248例病例和1248例对照（来自张家港和常州地区），二期验证是来自苏中地区的1000例病例和1803例对照（来自泰州和南通地区）。本研究全基因组筛选阶段1000例病例的基因型分析采用美国Illumina公司Omni Express芯片检测，983例对照的基因型分析采用Illumina公司的Omni中华芯片检测，两张芯片重叠的SNPs（595,310个SNPs）进入质量控制。通过对研究变量(SNPs)和研究对象这两方面的质量控制后，共951例病例（包括478例HCC的慢性HBV携带者和473例非HCC的慢性HBV携带者）和937例对照、490,610个SNPs位点进入后续分析，采用logistic回归模型计算SNPs相加模型的关联P值、关联强度比值比(odds ratio, OR)值以及95%可信区间(confidence interval, CI)。满足以下要求的位点进入一期验证：1)病例（951例）与对照（937例）关联P值≤1.0×10-5；2) HCC的病例（478例）与非HCC的病例（473例）与对照（937例）分别分析后关联P值≤1.0×10-3；3)同时满足上述两条标准的位点中具有高连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)(r2>0.8)的位点，则纳入P值最低的位点。一期验证的位点结果满足P≤0.05时将进入二期验证。最终本研究发现了两个新的慢性HBV感染易感SNPs：位于6p21.33区域的rs3130542（位于HLA-C下游, OR=1.39,95%CI=1.26-1.53, P=5.09×10-11）和位于22q11.21区域的rs4821116（位于UBE2L3上, OR=0.81,95%CI=0.75-0.87,P=1.69×10-9）。此外，我们还证实了日本人群GWAS识别出的位于6p21.32区域的rs7453920（位于HLA-DQ上）与慢性HBV感染相关(OR=0.54,95%CI=0.48-0.61, P=8.54×10-25)。HLA-DQ属于HLA II类分子，与HBV抗原递呈密切相关，rs7453920可能影响机体对HBV的适应性免疫应答；HLA-C属于HLA I类分子，rs3130542可能会影响抗HBV感染的细胞免疫途径。UBE2L3被报道与一些自身免疫性疾病相关，但与HBV感染相关的研究未见报道，其可能是HBV慢性感染新的易感基因，为阐明慢性HBV感染机制提供了新的思路。我们进一步分析了本研究发现的3个慢性HBV感染相关SNPs是否与HCC发生风险存在关联。在初筛阶段的478例HCC病例与473例非HCC病例中，3个SNPs与HCC均不存在显著关联。此外，我们在1300例独立的HBV阳性HCC病例中检测了这3个SNPs的基因型，以验证阶段的HBV携带者作为对照，也没有发现这3个SNPs与HCC存在显著关联。将上述两部分结果合并后，3个SNPs与HCC仍不存在显著关联(rs7453920: OR=0.90, P=2.39×10-1; rs3130542:OR=1.09, P=2.19×10-1; rs4821116: OR=1.03, P=6.54×10-1)。本研究发现的3个SNPs与慢性HBV感染相关，与HCC风险均不相关，提示这三个SNPs可能影响HBV感染慢性化过程，但并不参与慢性HBV感染向HCC进展的过程。本研究首次发现了位于染色体6p21.33和22q11.21区域的两个新的慢性HBV感染易感区域，同时验证了6p21.32区域与慢性HBV感染易感性的关联。本研究结果对识别和评价慢性HBV感染的遗传易感因素，指导慢性HBV感染的机制研究具有重要理论价值。本研究发现的慢性HBV感染的遗传易感标志物有望对HBV暴露高危人群的筛检及预防提供帮助。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
前言  11-21
材料与方法  21-43
结果  43-65
分析与讨论  65-70
总结  70-71
参考文献  71-79
综述  79-98
  参考文献  91-98
附录一  98-99
附录二  99-101
致谢  101

中国华东地区慢性乙型肝炎病毒感染的全基因组关联研究

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