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北京地区实验动物中绿脓杆菌耐药分析及PFGE和MLVA分型方法比较

作　者: 邢进
导　师: 吴军; 岳秉飞
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 绿脓杆菌耐药 PFGE MLVA 实验动物
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：了解北京地区实验动物中绿脓杆菌分离株的耐药情况、基因型分布和菌株间的同源性，对绿脓杆菌感染进行溯源和流行病学分析，为绿脓杆菌耐药机制的研究提供依据和菌种资源。比较脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）两种分型方法的优劣。为绿脓杆菌的研究提供北京地区的分型数据。进而为绿脓杆菌感染控制提供依据，同时保障实验动物质量和相关动物实验的顺利进行。方法：（1）收集2007年~2011年北京地区17家实验动物生产和使用单位的绿脓杆菌分离株，使用法国梅里埃API20E细菌鉴定试纸条生化试验及16SrRNA序列扩增和测序进行绿脓杆菌菌株的鉴定；（2）根据美国临床与实验标准化委员会（CLSI）标准和推荐方法，选择青霉素类哌拉西林（Piperacillin, PIP）、β-内酰胺酶抑制剂复合物哌拉西林/他巴唑坦（Piperacillin-tazobactam, PIP-TAZ）、头孢菌素类头孢他啶（Ceftazidime, CAZ）和头孢噻肟（Cefotaxime, CTX）、氨基糖苷类庆大霉素（Gentamicin, GEN）、喹诺酮类环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）、碳青霉素烯类亚胺培南（Imipenem, IMP）、多肽类多粘菌素E（Colistin, Coli）7类8种抗生素，采用琼脂稀释法收集的134株绿脓杆菌分离株进行药敏试验；通过IMP-EDTA协同实验和外膜蛋白OprD编码基因的扩增测序，对耐亚胺培南菌株进行耐药机制分析；（3）采用美国疾病预防控制中心推荐的脉冲场电泳方法（PFGE），经Spe I限制性内切酶酶切后的PFGE指纹图谱用Bionumerics软件进行处理和聚类分析；（4）采用串联重复可变序列分析（MLVA）方法对134株绿脓杆菌进行基因分型，经13个VNTR位点的扩增，利用Bioculator计算出各菌株的每个位点的重复序列数目，用Bionumerics软件对重复序列的多态性特征数据进行处理和聚类分析，并与PFGE分型结果相比较；结果：（1）经过API20E生化鉴定结果软件分析，从2988只实验动物和55份饮水样品中分离的135株疑似绿脓杆菌分离株，除PA73被鉴定为木糖氧化无色杆菌外，其余所有受试菌株的生化结果共产生了21种生化谱，第一鉴定结果均为绿脓杆菌，CMCC10110的API20E生化谱为220200463。其中PA001、PA002、PA060和PA075的鉴定ID%分别为25.2%、25.2%、57.7%和36.9%，其他菌株ID%在98.9~99.9之间，T指数在0.5~1之间。鉴定确认了134株为绿脓杆菌。（2）134株实验动物绿脓杆菌分离株经琼脂稀释法药敏试验，结果存在对CTX，IMP，Coli，GEN，CIP五种抗生素不同程度的耐药，其中对CTX的耐药率为11.9%；对IMP的耐药率为1.5%；对Coli的耐药率为2.2%；对GEN的耐药率为41%；对CIP的耐药率为1.5%；对PIP、PIP-TAZ和CAZ均敏感。存在CTX-Coli-GEN-CIP（n=1）和CTX-Coli-CIP（n=1）多重耐药株和CTX-GEN（n=11）双重耐药。所有耐药菌株均分离自北京市丰台区。对2株亚胺培南耐药株的耐药机制分析表明外膜蛋白OprD编码基因的变异是导致对亚胺培南耐药的主要原因。（3）134株绿脓杆菌分离株经Spe I限制性内切酶酶切后的PFGE指纹图谱用Bionumerics软件进行处理和聚类分析，所有菌株被切出15~20条DNA片段，大小在20Kb~1200Kb之间。共被分为了22个基因簇（A~V），108个基因型，分辨力指数D=0.955。优势簇为J、M、N和U，分别占39/134（29.1%）、15/134（11.2%）、22/134（16.4%）和13/134（9.7%）。各分离地之间的绿脓杆菌大部分为散发感染，个别不同来源菌株具有较高的基因相似度。（4）MLVA所有菌株共被分为32个基因簇，51个基因型，分辨力指数D=0.763，低于PFGE方法。其中12簇的菌数最多，占到了56.7%，其次是21簇，占14.2%。基因分型结果与MLVA数据库比对，各有1株菌与利比亚的和西班牙的分离株有较高同源性。（5）实验动物中绿脓杆菌感染呈现散在分布，来源和时间不同，基因型也随之不同。PFGE与MLVA两方法对IMP、Coli、CIP和GEN耐药株的分型能力相同，PFGE对CTX耐药菌株的分型能力略优于MLVA。结论：北京地区实验动物绿脓杆菌存在亚胺培南、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星和多粘菌素E的耐药菌株，对庆大霉素和头孢噻肟的耐药率较高。亚胺培南耐药株的耐药机制是由于外膜蛋白OprD编码基因的变异所引起。药敏结果表明大部分菌株对抗生素仍然较敏感，是研究绿脓杆菌耐药机制的良好资源。PFGE与MLVA方法对受试菌株均能有效分型，显示北京地区实验动物中绿脓杆菌的基因型比较丰富，感染源较多，且不同分离地存在基因高相似度的分离株。同一分离地的PA分离株随时间不同表现出不同的基因型，表明存在不同的感染源或变异。实验动物中绿脓杆菌的产生耐药的原因主要为自身变异。两种分型方法对耐药菌株的分型效果基本相同。PFGE的分型能力优于MLVA，而MLVA方法操作简便快速，在检测基因间的相关度方面优于PFGE。

全文目录

缩略语表  4-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-13
第一部分实验动物中绿脓杆菌的分离鉴定  13-18
  材料与方法  13-16
  结果  16-17
  讨论  17-18
第二部分绿脓杆菌药敏分析及耐亚胺培南菌株的耐药机制  18-30
  材料与方法  19-24
  结果  24-27
  讨论  27-30
第三部分绿脓杆菌 PFGE 分型研究  30-44
  材料与方法  30-37
  结果  37-42
  讨论  42-44
第四部分绿脓杆菌MLVA分型研究及与PFGE分型方法的比较  44-62
  材料和方法  44-48
  结果  48-60
  讨论  60-62
总结  62-63
参考文献  63-69
附录  69-88
综述  88-106
  参考文献  99-106
附发表文章  106-117
个人简历  117-118
致谢  118

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