学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

L1逆转座子编码序列ORF1的功能研究

作　者: 王越
导　师: 于继云; 朱运峰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: LINE-1 ORF1 细胞增殖基因表达调控
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 29次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

近来研究显示,在基因组中过去认为“垃圾序列”的一些重复序列,可能具有重要的功能。这些重复序列中,大部分是移动元件,包括转座子(transposon)与逆转座子(retrotransposon),其中逆转座子分为含有末端重复序列(LTR,long terminal repeats)与非含有末端重复序列两类,后者为SINEs(short interspersed nuclear elements,短散布重复序列)和LINEs(long interspersed nuclear elements,长散布重复序列)。在LINEs中LINE-1是其主要组成成员,在基因组中,绝大部分LINE-1是以5’截短的形式存在,全长基因包括两个开放阅读框ORF1和ORF2,表达两种蛋白ORF-1p和ORF-2p,相对于ORF-2p,ORF-1p的表达大大过量。其中ORF-1p具有与自身核酸结合活性,形成核酸蛋白复合物(RNP),而ORF-2p具有内核酸酶及外切酶活性,与ORF1p一起执行逆转座功能,其机制为TPRT(Target-primed reverse transcription)。在正常分化的细胞中,LINE-1的启动子为高度甲基化状态,造成其沉默,但生殖细胞发育、胚胎发育的早期以及肿瘤细胞中则为激活状态。研究表明在几乎所有的肿瘤细胞中L1均为激活状态,提示其激活可能涉及肿瘤发生的共同机制。所以通过L1的研究对了解肿瘤发生、发展和调控的分子机理以及肿瘤药物靶标具有重要意义,同时也为开发新型的肿瘤治疗药物提供新的靶点。研究发现,ORF-1p与目前所有已知蛋白均缺乏同源性,同时其表达量又远过量于与其共同参与转座的ORF-2p,提示其在肿瘤细胞中可能具有重要的作用。本研究对其进行了有关探索。主要表现一下几个方面:(1)ORF-1p过表达对细胞生物学特征的影响:在此过程中,我们分别构建含有人L1-ORF1p完整、突变体序列重组表达载体以及小鼠ML1-ORF1p重组表达载体,转染细胞后进行RT-PCR、Western Blot以及流式细胞术方法检测,为进一步研究L1-ORF1蛋白及基因的功能提供了基础。结果显示,人与小鼠ORF1p完整蛋白均能显著促进细胞增殖,在人L1-ORF1p不同突变体中,位于第109氨基酸处终止突变的全长序列也能促进细胞增殖,随后对含有109氨基酸的基因进行表达发现,其表达产物不能促进细胞增殖,另外其它全长多处点突变的ORF1p也不能促进细胞增殖,多处突变会造成蛋白高级结构的改变,从而影响其功能的执行,同时非全长蛋白在其全长RNA的帮助下具有全长蛋白功能,说明ORF1在基因水平影响细胞增殖。随后对转染细胞的其它细胞生物学特征进行了鉴定,发现小鼠ORF1p的表达能显著减少NIH3T3细胞周期S期,促进小鼠NIH3T3细胞的细胞周期运转。人ORF1p的天然以及ORF1p109突变的全长构建体表达产物能够使HEK293细胞的S期减少,加快细胞周期运转,而全长突变蛋白ORF1pm、ORF1p48以及ORF1p109e则对细胞周期的S期则没有显著的影响,此结果与细胞增殖实验结果一致。在正常细胞中过表达L1-ORF1p可促进细胞增殖,加快细胞周期,在109氨基酸处带有终止密码的全长基因突变体具有相同的作用,而终止密码位于其它部位的突变体则没有相似的作用,以上提示L1-ORF1的功能可能在RNA水平上起作用,而且与RNA中特异的序列有关。(2)5’端不同长度截短的L1-ORF1序列对相邻基因的影响:在此过程中,我们构建了L1-ORF1基因插入到报告基因上下游的报告基因表达载体,由于在天然存在的状态下L1常存在5’端缺失,所以本研究选取三种不同长度的L1-ORF1片段,分别是全长片段、2/3全长片段(5’端截短1/3)、1/3全长片段(5’端截短2/3)。通过设计引物插入酶切位点将人和小鼠的三种不同片段分别插入到pCBG99-control报告基因表达载体中萤光素酶报告基因的上游和下游。为进一步检测L1-ORF1基因对相邻基因表达影响提供了条件。结果显示,L1-ORF1基因片段在报告基因上游和下游都能抑制报告基因的表达,而且基因片段的不同片段(5’端截短)对报告基因的表达也有不同的影响。在插入报告基因上游,L1-ORF1基因片段对报告基因影响最为显著的是只含3’端1/3的小片段,其可能原因是此区域位于基因保守区含有特定结构域;在插入报告基因下游,L1-ORF1基因片段对报告基因的影响随片段长度增加而加强。(3)L1-ORF1序列对相邻基因表达影响的机制:在此过程中,我们对细胞进行甲基化抑制处理,结果显示在甲基转移酶受到抑制的情况下,L1-ORF1基因对萤光素酶报告基因的抑制作用有明显的降低,说明L1-ORF1基因的相邻基因起抑制作用有可能通过甲基化作用而实现,表明其作用机制可能是表观遗传学调控的结果。综上说明,L1-ORF1的表达能通过顺式和反式调控作用促进细胞生长,其在肿瘤的发生与发展过程中具有重要的作用,并可能作为肿瘤药物治疗的新靶点。本研究初步探讨了L1-ORF1蛋白和基因的功能,为进一步研究其作用机制奠定了基础。

全文目录

摘要  5-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
第一部分 L1 编码序列ORF1 重组表达载体的构建  15-35
  实验目的  15
  材料与方法  15-26
  结果  26-32
  讨论  32-35
第二部分 L1 编码序列ORF1 对相邻基因表达影响研究  35-49
  实验目的  35
  材料与方法  35-43
  结果  43-48
  讨论  48-49
第三部分 L1 编码序列ORF1 对细胞调控作用的初步研究  49-57
  实验目的  49
  材料与方法  49-51
  结果  51-54
  讨论  54-57
参考文献  57-61
全文总结  61-63
致谢  63-65
附录1 英文缩略词表  65-67
附录2 硕士期间发表文章  67-69
附录3 文献综述  69-73
  参考文献  72-73

L1逆转座子编码序列ORF1的功能研究

内容摘要

全文目录

相似论文