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贝氏柯克斯体的免疫蛋白质组学研究

作　者: 熊小路
导　师: 温博海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 贝氏柯克斯体 Q热免疫蛋白质组蛋白芯片保护性抗原
分类号: R392.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)是Q热的病原菌,对人和动物有极强的感染力,可通过气溶胶扩散经呼吸道进入体内导致感染。人类感染贝氏柯克斯体可引发肺炎、肝炎、心内膜炎等严重疾病。贝氏柯克斯体的高致病性和对环境、理化因素的高抵抗力使其成为重要的生物战剂/生物恐怖剂。Q热最常用的特异性诊断方法为血清学诊断,包括间接免疫荧光(IFA)技术,补体结合(CF)实验,酶联免疫吸附(ELISA)技术等。这些检测方法都需要纯化的贝氏柯克斯体全菌作为抗原,由于提取纯化贝氏柯克斯体的防护要求高、工艺复杂,造成了这些检测方法难以大规模推广和使用。疫苗接种为预防贝氏柯克斯体感染的有效手段。虽然灭活贝氏柯克斯体全菌疫苗具有良好的免疫保护效果,但是其难以制备和较强的副作用限制了它的推广应用。因此,许多国家和地区都致力于研制安全、可靠、副作用小的新型Q热疫苗。本研究通过高通量的免疫蛋白质组学来筛选贝氏柯克斯体菌体蛋白抗原,并制备相应的重组蛋白,以及评价重组蛋白抗原的免疫原性和免疫保护效能,为Q热分子疫苗和分子诊断试剂的研发提供候选蛋白抗原。本研究采用泛影葡胺线性密度梯度法从鸡胚培养物中分离出贝氏柯克斯体新桥株。用纯化的贝氏柯克斯体新桥株腹腔接种感染小鼠,于感染后1、2、3、4周分别处死小鼠,收集不同感染时期的抗血清,并采用间接免疫荧光法检测感染小鼠血清特异性抗体水平。再用贝氏柯克斯体特异的实时荧光定量PCR检测感染小鼠组织中的贝氏柯克斯体载量,以分析新桥株对BALB/c小鼠的感染特征。结果显示感染后4周内,小鼠肝、脾、肺组织中均检出大量贝氏柯克斯体,第1周检出量最高,脾的含量显著高于肝和肺,肝的含量显著高于肺。随着感染时间延长,贝氏柯克斯体检出量呈下降趋势,但血清特异性抗体水平则继续升高。随后利用双向电泳技术将纯化贝氏柯克斯体全菌蛋白进行分离,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转移到PVDF膜上的贝氏柯克斯体蛋白进行免疫印迹反应,并通过蛋白质谱技术完成了对这些蛋白的鉴定。结果显示1、2、3、4周感染小鼠血清鉴定的印迹反应阳性蛋白分别为0、4、9、14个,其中印迹反应最强烈的4个蛋白为GroEL、Com1、Mip、OmpH。用Q热患者血清与贝氏柯克斯体蛋白进行免疫印迹反应,鉴定出了15个印迹反应阳性蛋白,其中有9个蛋白为Q热患者血清与贝氏柯克斯体感染小鼠血清共同识别抗原。采用分子克隆技术,将鉴定的免疫印迹反应阳性蛋白的基因克隆和重组表达。除了rspB基因,其他19个印迹反应阳性蛋白基因均被高效表达。采用镍离子亲和层析方法(Ni-NTA)分别从IPTG诱导的转化菌中纯化19个重组蛋白。将纯化的重组蛋白点制成一张蛋白芯片,以此芯片与贝氏柯克斯体感染的鼠血清反应。结果与贝氏柯克斯体感染1、2、3、4周小鼠血清反应的蛋白为0、16、19、18个,其中反应荧光强度最强的4个重组蛋白依次为GroEL、Mip、OmpH、Com1。将蛋白芯片与56份Q热病人血清和25份正常人血清进行反应,当单份病人血清与单个蛋白点的反应荧光信号值大于正常人血清与对应蛋白点反应荧光信号平均值加2个标准差时结果为阳性。结果GroEl、YbgF、RplL、Mip、OmpH、Com1、Dnak共7个重组蛋白被急性晚期Q热病人血清识别的阳性率大于40%。因此,这些蛋白有望成为构建Q热分子诊断试剂的侯选蛋白。将重组蛋白抗原GroEL、Com1、Mip、YbgF分别刺激体外培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞,以贝氏柯克斯体全菌抗原(WCA)和大肠杆菌脂多糖(LPS)作阳性对照,以pET-32a(+)表达的标签蛋白(TrxA)作阴性对照,并以蛋白洗脱缓冲液(elution buffer)作为模拟刺激。24h后收集抗原刺激的树突状细胞,用流式细胞仪分析树突状细胞表面分子,结果发现不同抗原刺激树突状细胞的表面分子表达显著高于模拟刺激组。再将不同抗原激活的树突状细胞分别腹腔转移至正常小鼠,转移后1天、7天、14天分别用贝氏柯克斯体毒株攻击受体小鼠,并采用定量PCR检测小鼠脾脏贝氏柯克斯体载量,结果显示接受WCA、Com1或Mip激活树突状细胞的小鼠柯克斯体载量显著低于未接受任何刺激的阴性对照组,而接受其它抗原(GroEL/YbgF/TrxA/LPS)激活树突状细胞的小鼠贝氏柯克斯体载量与阴性对照组相比无显著性差异。说明重组蛋白抗原Com1和Mip能够诱导特异性免疫保护,为贝氏柯克斯体保护性抗原。将重组蛋白GroEL、Com1、Mip刺激的树突状细胞分别与纯化的CD4+和CD8+T细胞共培养,以全菌抗原(WCA)、标签蛋白TrxA、elution buffer刺激的树突状细胞与T细胞共培养分别作为阳性和阴性对照。24h后收集抗原刺激的树突状细胞,用流式细胞技术分析T细胞表面分子,结果发现全菌抗原(WCA)和重组蛋白GroEL、Com1、Mip刺激树突状细胞的表面分子CD69的表达水平显著高于对照刺激组。再用流式细胞技术分析T细胞细胞因子表达情况,结果显示与WCA、Com1或Mip激活树突细胞相互作用的T细胞的IFN-γ表达水平均显著高于与其它组的T细胞,提示保护性抗原刺激的树突状细胞介导的特异性免疫保护与该抗原刺激T细胞表达高水平的IFN-γ以及随后激活巨噬细胞的杀菌活性密切相关。

全文目录

缩略词表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-14
第一部分贝氏柯克斯体的免疫蛋白质组学  14-32
  引言  14
  1 材料  14-19
  2 方法  19-24
  3 结果  24-30
  4 讨论  30-32
第二部分贝氏柯克斯体免疫反应阳性蛋白的表达与重组蛋白芯片的构建  32-48
  引言  32
  1 材料  32-37
  2 方法  37-42
  3 结果  42-46
  4 讨论  46-48
第三部分贝氏柯克斯体抗原刺激的树突状细胞对BALB/c小鼠的特异性免疫保护  48-64
  引言  48
  1 材料  48-50
  2 方法  50-54
  3 结果  54-61
  4 讨论  61-64
结论  64-65
参考文献  65-71
附录  71-73
综述  73-82
  参考文献  78-82
个人简历  82-85
致谢  85

贝氏柯克斯体的免疫蛋白质组学研究

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