学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

甲型流感病毒样颗粒疫苗的初步研究

作　者: 高啸
导　师: 王希良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 甲型H1N1 病毒样颗粒 通用疫苗 M2蛋白外功能区 核蛋白表位
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 135次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


流感是世界范围内广泛流行的呼吸系统传染病,每年都造成大量的住院及死亡病例。截至2010年7月18日,爆发于墨西哥的甲型H1N1流感已在全球214个国家造成18,336人死亡;自2003年以来,H5N1高致病性禽流感病毒已在世界范围内造成310人死亡,且死亡率高达59%。疫苗是防控流感最为有效的手段。流感疫苗的发展经历了灭活疫苗、裂解疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等阶段,季节性流感裂解疫苗虽然能在人群中产生有效保护作用,但是依然存在许多问题。首先,传统流感疫苗的生产工艺依赖于鸡胚,难以应对流感大规模爆发对疫苗的需求,且鸡胚卵清蛋白易引起过敏,至今还没有针对老年人、儿童及特殊人群理想的流感疫苗,因此现有流感疫苗的生产工艺亟待更新。其次,现有流感疫苗的有效成分是流感病毒HA和NA抗原。流感病毒具有易错倾向的RNA依赖性RNA聚合酶,使得HA和NA抗原不断发生抗原漂移;流感病毒的宿主极为广泛,可以感染鸟类、马、猪等多种动物并在这些动物体内发生基因节段的重组。因此,现有的季节性流感疫苗每年都需要更新。这不但需要对每年的病毒流行株进行预测,而且,每年接种流感疫苗,除了加重国家公共卫生经费的负担造成大量不必要的浪费之外,还不可避免的在人体中引入大量外源核酸,对人体健康造成潜在的威胁。因此,更新现有流感疫苗生产工艺,研发新类型的流感疫苗成为流感疫苗研究领域的发展方向。病毒样颗粒（Virus-like particle, VLP）作为一种候选疫苗具有免疫原性好,没有感染性,稳定性好,不易失活等特点,因此在病毒感染性疾病的疫苗研发中极具研究价值。国内外已有大量关于病毒样颗粒的研究报道,包括人类乳头瘤病毒样颗粒、人类免疫缺陷病毒样颗粒、轮状病毒样颗粒等。其中,HPV-VLP疫苗已经在欧洲和美国上市,展现出了VLP疫苗良好的应用前景。由昆虫细胞衍生的流感VLP是最有希望替代现有流感疫苗的候选疫苗。目前已经成功重组的流感VLP包括H9N2、H3N2、H1N1、H5N1等多种亚型,这些VLP都具有免疫原性强,保护效果好,易于构建表达等优点。因此,研制流感病毒样颗粒疫苗具有极为重要的科学价值和社会效益。但是国内关于流感病毒样颗粒的文献还比较少,国外也未见关于将流感病毒样颗粒与现行裂解疫苗进行比较的报道。现有的大部分通用疫苗研究以人来源的流感病毒M2蛋白外功能区（M2e）序列作为靶点。然而,M2e免疫原性低,M2e氨基酸序列在人来源和禽来源的A型流感病毒之间存在5-6个氨基酸残基的差异,且M2e诱导机体产生细胞免疫的能力较差。NP418-426表位是NP蛋白的免疫优势表位,与IFN-γ的产生高度相关并且能够有效的诱导特异的CTL发生免疫应答;禽流感病毒来源的NP418-426表位可以被人流感病毒特异的CTL交叉识别。因此,NP418-426表位有希望成为基于人来源M2e序列的流感病毒通用疫苗的重要组成成分,用以提高流感通用疫苗的种间交叉免疫保护效果,进一步提高通用疫苗的广谱性。乙肝核心蛋白（HBc）是使用最为广泛的外源表位载体。HBc可在体内或体外自组装成病毒样颗粒（VLP）,将外源表位与HBc构建融合蛋白可以有效的诱导T细胞和B细胞免疫反应。基于以上研究背景,本研究分为两部分:第一部分甲型H1N1病毒样颗粒疫苗的初步研究1.通过昆虫-杆状病毒表达系统表达A/California/07/2009（H1N1）毒株的VLP。使用DEAE阴离子交换介质、Sepharose 4FF凝胶介质纯化甲型H1N1 VLP。电镜观察可知,纯化的甲型H1N1 VLP结构完整,直径在100nm左右。通过Western blot、血凝、单向免疫扩散等实验进一步证实,获得了重组甲型H1N1 VLP蛋白抗原并具有良好的免疫活性。2.以10ug HA为免疫剂量,腹腔免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠,ELISA结果证实,研制的甲型H1N1 VLP能够诱导机体产生高滴度的特异性抗体,且甲型H1N1 VLP较甲型H1N1裂解疫苗能够诱导机体产生更高滴度的IgG抗体。3.选用A/Beijing/501/2009 （H1N1）甲型H1N1流行株进行攻毒,结果显示,甲型H1N1 VLP候选疫苗能够保护小鼠抵抗50LD50剂量的致死性攻击,保护率达到100%。结论:研制的甲型H1N1 VLP候选疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,且生产较为便利。昆虫细胞生产的流感病毒VLP是值得深入研究,以期有希望替代现有流感疫苗的候选疫苗之一。第二部分甲型流感通用病毒样颗粒疫苗的初步研究1.使用大肠杆菌表达融合蛋白3M2e-NP-HBc、3M2e-HBc以及HBc N端149个氨基酸HBc-N149。采用His-trap纯化介质对重组蛋白进行纯化。电镜观察可知,纯化的重组蛋白可形成大小均一,结构完整的病毒样颗粒。通过M2e单克隆抗体进行Western blot实验可知,3M2e-NP-HBc及3M2e-HBc VLP抗原具有良好的M2e特异的免疫活性。2.以20ug重组蛋白为免疫剂量,选取4-6周龄雌性Balb/c小鼠进行动物实验可知,重组3M2e-NP-HBc和3M2e-HBc VLP抗原均能够诱导机体产生高滴度的M2e特异性抗体。3M2e-NP-HBc较3M2e-HBc能够诱导机体产生更高滴度的IgG2a抗体且3M2e-NP-HBc较3M2e-HBc能够刺激机体产生更多的IFN-γ分泌型淋巴细胞。3.分别使用A/Beijing/501/2009 （H1N1）甲型H1N1毒株、A/PR/8/34（H1N1）及A/Ostrich/SuZhou/097/2003 （H5N1）高致病性禽流感毒株进行攻毒实验。结果显示,3M2e-NP-HBc和3 2e HBc均能够保护小鼠抵抗10LD50的A/Beiji g/501/2 09 （H1N1）、A/PR/8/34（H1N1）毒株的致死性攻击,保护率达到100%。3M2e-NP-HBc较3M2e-HBc能够更好的保护小鼠抵抗10LD50的A/Ostrich/SuZhou/097/2003 （H5N1）毒株的致死性攻击。结论:NP418-426表位的嵌入能够有效的诱导机体产生细胞免疫应答,有效的提高基于M2e的甲型流感通用候选疫苗的种间交叉保护效果。流感病毒内部蛋白作为潜在的通用疫苗候选抗原应当进行深入的研究。

全文目录


缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-16
第一部分 甲型H1N1 病毒样颗粒疫苗的初步研究  16-35
  材料与方法  16-25
  结果  25-33
  讨论  33-34
  结论  34-35
第二部分 甲型流感通用病毒样颗粒疫苗的初步研究  35-57
  材料与方法  35-43
  结果  43-56
  讨论  56-57
  结论  57
参考文献  57-64
发表文章  64
甲型 H1N1 流感病毒样颗粒疫苗的初步研究  64-74
  参考文献  72-74
流感病毒样颗粒疫苗的产生及其免疫保护的研究进展  74-81
  参考文献  78-81
个人简历  81-82
致谢  82

相似论文

  1. 甲型H1N1流感的传播预测与控制,R184
  2. 甲型H1N1流感病毒（2009）HA蛋白的原核表达及酶免检测研究,R392.1
  3. 展示生长抑素的猪细小病毒样颗粒构建及其免疫效力研究,S852.65
  4. 2005-2010年济南市季节性流感及新甲型H1N1流感监测数据分析,R511.7
  5. 基于两类传染病模型模糊控制的研究,O231.2
  6. HBcAg展示技术表达含有礁珊瑚荧光蛋白的病毒样颗粒,R373
  7. LSAW传感器及RCA技术在人畜共患性病原体检测中的应用研究,R440
  8. 甲型H1N1流感感染的心肌损伤分析,R511.7
  9. 上海地区甲型H1N1与季节性甲型流感病毒的流行与病毒变异研究,R511.7
  10. 山西省普通人群甲型H1N1流感病毒感染水平调查研究,R181.3
  11. 我国防控甲型“H1N1”流感中的若干伦理冲突分析,R-052
  12. 53例重症甲型H1N1流感临床分析,R516.3
  13. 我国登革3型病毒2009年义乌流行株生物学特性研究,R373
  14. 新甲型H1N1流感病毒小鼠致死模型的建立及初步研究,S852.65
  15. 山东省甲型H1N1感染病例临床资料分析及奥司他韦疗效研究,R511.7
  16. 甲型H1N1流感重症病例危险因素的研究,R511.7
  17. 甲型H1N1流感的社区防控,R184
  18. 淄博市甲型H1N1流感感染状况调查研究,R181.3
  19. 某三级甲等综合医院门诊发热病人对甲型H1N1流感认知及影响因素研究,R184
  20. 不同H1N1流感病毒感染A549细胞的生物学特征及对细胞基因表达的影响研究,R373
  21. 甲型H1N1流感病毒致宿主细胞氧化损伤机制的研究,R511.7

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
© 2012 www.xueweilunwen.com