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抗BLyS单链抗体的构建、纯化和初步活性鉴定

作　者: 鲁战平
导　师: 孙剑
学　校: 天津大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: BLyS 单链抗体 原核表达 结合活性
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 25次
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内容摘要


B淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stilulator，BLyS）是一种主要由巨噬细胞和树突状细胞产生的肿瘤坏死因子，广泛参与了机体免疫，对外周B淋巴细胞的生存、成熟和分化，生发中心的形成，浆细胞抗体的分泌等生命过程有着至关重要的作用。BLyS的不正常表达与人类多种疾病相关，如免疫缺陷病，自身免疫性疾病和B细胞淋巴瘤等。研究表明自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤患者体内的BLyS水平明显升高，而且BLyS信号的阻断对此类疾病的发展有显著的治疗作用。单链抗体（ScFv）既具备抗原结合得特异性，又具有分子量小、穿透力强免疫原性低的特点，在免疫学和生物医学领域有着广阔的应用前景。因此抗BLyS单链抗体具有治疗自身免疫性疾病和B淋巴瘤的潜在作用。本课题研究方法：运用计算机模拟技术设计抗BLyS单链抗体的基因序列（VHL和MHL），用重叠PCR等方法构建重组质粒，借助原核表达系统表达并纯化目的蛋白，通过ELISA技术初步检测抗体的活性。主要研究成果：（一）扩增了两种抗体的重链和轻链可变区，并用重叠PCR方法构建了两种单链抗体基因片段，并且分别添加了Myc标签和Fc标签，VHL-Myc大小为780bp，MHL-Fc大小为1500bp。（二）构建了VHL-Myc-pET28a和MHL-Fc-pET28a表达载体，对蛋白表达的诱导条件进行了优化，获得了较高水平的表达。蛋白大量表达后利用Ni亲和柱从包涵体中纯化出两种目的蛋白。（三）体外活性检测结果显示VHL-Myc能够与特异性BLyS结合，并且这种结合是剂量依赖的。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 文献综述  8-16
  1.1 BLyS的结构及表达  8-9
  1.2 BLyS的信号通路  9-10
  1.3 BLyS的生物学功能  10-12
    1.3.1 BLyS对B细胞的作用  10-11
    1.3.2 BLyS对T细胞的作用  11-12
  1.4 BLyS相关疾病  12-14
    1.4.1 免疫缺陷病  12
    1.4.2 自身免疫性疾病  12-13
      1.4.2.1 系统性红斑狼疮  12-13
      1.4.2.2 类风湿性关节炎  13
      1.4.2.3 干燥综合症  13
    1.4.3 血液系统恶性肿瘤  13-14
  1.5 以BLyS为靶点的治疗药物研究进展  14-15
    1.5.1 BLyS拮抗剂  14
    1.5.2 抗BLyS单克隆抗体  14-15
    1.5.3 其它BLyS相关药物  15
  1.6 总结与展望  15-16
第二章 实验材料和方法  16-33
  2.1 引言  16
  2.2 实验材料  16-23
    2.2.1 菌株  16
    2.2.2 载体  16-17
    2.2.3 工具酶、抗体及试剂盒  17-18
    2.2.4 常用试剂  18-20
    2.2.5 实验仪器  20-21
    2.2.6 溶液的配制  21-23
  2.3 方法  23-33
    2.3.1 感受态细胞的制备  23-24
    2.3.2 VHL-Myc单链抗体的构建、纯化和活性检测  24-31
      2.3.2.1 VHL-Myc抗体的构建  24-27
      2.3.2.2 VHL-Myc抗体的表达及纯化  27-29
      2.3.2.3 VHL-Myc抗体的体外活性检测  29-31
    2.3.3 MHL-Fc融合蛋白的构建、纯化和活性检测  31-33
      2.3.3.1 MHL-Fc融合蛋白的构建  31
      2.3.3.2 MHL-Fc融合蛋白的表达及纯化  31-32
      2.3.3.3 MHL-Fc融合蛋白的抗原活性检测  32-33
第三章 实验结果与讨论  33-49
  3.1 VHL-Myc单链抗体的构建、纯化和活性检测  33-43
    3.1.1 VHL-Myc单链抗体的构建  33-35
    3.1.2 VHL-Myc单链抗体的表达及纯化  35-41
      3.1.2.1 表达条件的优化  36-39
      3.1.2.2 VHL-Myc蛋白的纯化  39-41
    3.1.3 VHL-Myc单链抗体的体外活性检测  41-43
      3.1.3.1 VHL-Myc抗原活性的检测  41-42
      3.1.3.2 VHL-Myc与BLyS的结合活性检测  42-43
  3.2 MHL-Fc融合蛋白的构建、纯化和活性检测  43-49
    3.2.1 MHL-Fc融合蛋白的构建  43-46
    3.2.2 MHL-Fc融合蛋白的表达及纯化  46-48
    3.2.3 MHL-Fc融合蛋白抗原活性的检测  48-49
第四章 实验总结  49-50
参考文献  50-55
发表论文和科研情况说明  55-56
附录  56-57
致谢  57

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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