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喷鼻流感三价裂解疫苗的制备和免疫效果的初步研究

作　者: 石颖
导　师: 王希良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 壳聚糖季铵盐水凝胶传递系统 rIL-1β 流感病毒抗原免疫应答效果喷鼻疫苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

自上世纪以来，人类历史上曾四次发生流行性感冒的大流行。流感是由流感病毒引起的世界范围的传染性疾病，以损害呼吸系统为主，严重伴有主要并发症，对人类的健康造成严重的威胁。在1918年爆发的“西班牙流感”疫情，造成近4000万人的死亡。1957年及1968年爆发的两次大流感，全球感染人数均高达30%，死亡人口超过30万人。本世纪初出现的H5N1高致病性禽流感和2009年的甲型H1N1流感疫情，再次严重威胁人们的健康，其危害性日益得到人们的关注与重视。造成流感流行的主要原因是：流感病毒易发生抗原变异，且传染性强，传播迅速，易发生大范围流行。接种疫苗是目前有效防治流感的手段之一。现有的流感疫苗接种分为注射灭活疫苗与喷鼻活疫苗两种，然而目前仍以注射免疫为主。但是注射疫苗接种方式繁琐、不能产生有效的黏膜免疫和细胞免疫应答效果、对于流感各亚型之间的交叉保护作用欠佳，而且对于特殊人群、如老人和儿童的免疫保护效果更加不能达到理想效果，这对流感的防控带来极大的挑战。喷鼻疫苗的出现和飞速发展无疑为流感疫苗的研制及发展带来了新的思路和发展空间。已有研究表明，呼吸道黏膜是流感病毒感染机体的部位，也是机体对外源抗原产生免疫应答、防御病原微生物感染的免疫器官。黏膜系统是人体抵御外界抗原入侵的第一道防线，鼻黏膜途径的疫苗接种更接近于自然感染，且抗原用量较少，即能够诱导黏膜免疫应答反应。喷鼻免疫能够通过在黏膜的局部免疫引发系统免疫，从而加强病原体感染的免疫防御机制，提高了免疫的有效性，亦避免了注射免疫带来的繁琐过程。喷鼻免疫的瓶颈问题在于其量效难以把握。喷鼻免疫过程中，黏膜免疫系统的复杂性及处于免疫抑制占优势的状态都可影响疫苗发挥作用，且疫苗进入鼻腔以后会有少量进入口腔和消化道，或流出体外。故此，喷鼻疫苗如何增效及量效关系，是喷鼻疫苗的研制中需要解决的重要问题。本研究中，以壳聚糖、壳聚糖季铵盐、壳聚糖水凝胶和壳聚糖季铵盐水凝胶分别作为流感喷鼻疫苗的传递系统，以甲型H1N1流感裂解病毒和甲型H1N1流感灭活全病毒作为待选抗原，以IL-1β、IL-18、IL-33和可溶性ViE作为候选佐剂，制备不同喷鼻流感疫苗的组合物，通过动物实验筛选喷鼻甲型H1N1流感疫苗的组成。结果发现，当壳聚糖季铵盐水凝胶作为疫苗传递系统、IL-1β作为黏膜佐剂、甲型H1N1流感裂解病毒作为抗原时，所组成的组合物免疫效果最佳。进一步通过在大肠杆菌中高效表达并分离纯化了重组人IL-1β蛋白佐剂，并检测其蛋白表达率、纯度及生物活性。将rIL-1β蛋白作为作为甲型H1N1喷鼻流感裂解疫苗的佐剂免疫小鼠，评价其作为佐剂的有效性，由此进行喷鼻流感三价裂解疫苗的制备和免疫效果的初步研究。本研究主要包括以下三部分：1、喷鼻流感疫苗传递系统、佐剂和抗原的筛选与确定。其研究进展如下；（1）喷鼻流感疫苗传递系统的筛选：以壳聚糖、壳聚糖季铵盐、壳聚糖水凝胶和壳聚糖季铵盐水凝胶为待选疫苗载体系统，分别以甲型H1N1流感裂解病毒为疫苗抗原（4μg）与rIL-1β（2μg）制备喷鼻组合物流感疫苗，同时以单抗原无佐剂组作为对照组，PBS组为空白组，分别免疫Balb/c小鼠，共免疫两次，间隔时间为两周。通过检测小鼠血清中IgG效价、血抑效价（HI）和肺、鼻冲洗液中sIgA效价，初步评价其有效性。结果表明，壳聚糖季铵盐水凝胶作为喷鼻疫苗传递系统的作用好于壳聚糖、壳聚糖季铵盐和壳聚糖水凝胶，可有效诱导产生机体的体液免疫和黏膜免疫。在此基础之上，对壳聚糖季铵盐水凝胶的用量进行筛选，制备不同浓度的水凝胶-抗原组合物，使水凝胶与抗原的比分别为1:1、1:2和1:4，从结果可看出，当水凝胶与抗原的比为1:1时，疫苗免疫效果最佳。（2）喷鼻流感疫苗抗原的筛选：以甲型H1N1流感裂解病毒和灭活全病毒作为疫苗抗原，并分别以壳聚糖季铵盐水凝胶作为疫苗传递系统（1:1）与rIL-1β（2μg）制备喷鼻组合物流感疫苗，分别免疫Balb/c小鼠，共免疫两次，间隔时间为两周。通过检测小鼠血清中IgG效价、血抑效价（HI）和肺、鼻冲洗液中sIgA效价，对抗原进行初步筛选。结果表明，与甲型H1N1流感灭活全病毒相比，甲型H1N1流感裂解病毒作为喷鼻疫苗的抗原引起的免疫应答水平较好。（3）喷鼻流感疫苗黏膜佐剂的筛选：以IL-1β、IL-18、IL-33、可溶性ViE为待选疫苗佐剂，各2μg剂量，分别与壳聚糖季铵盐水凝胶传递载体与甲型H1N1流感裂解病毒抗原（4μg）以1:1比例充分混合，制备喷鼻流感疫苗，分别免疫Balb/c小鼠，共免疫两次，间隔时间为两周。通过血清检测其IgG及其亚型抗体效价、血抑效价，鼻、肺、阴道冲洗液的分泌型抗体效价，筛选出最佳佐剂。实验结果表明，IL-1β与其它几种佐剂相比，疫苗佐剂效果较好，引起免疫应答水平较高。2、重组人IL-1β蛋白佐剂的制备及评价：从健康人外周血中分离白细胞，提取其总RNA，并通过PT-PCR方法获得人源IL-1β基因序列的cDNA序列，构建表达载体pET-24a(+)-IL-1β，在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达。对表达产物进行分离纯化，并优化其表达及纯化条件，最后检定其表达量、纯度、蛋白浓度和生物活性，以及其作为佐剂的有效性。结果表明，rIL-1β诱导表达的最佳培养温度为33℃，培养时间为24h，初步纯化的NaCl洗脱浓度为20mmol。表达重组的IL-1β蛋白浓度为2.25mg/mL，表达量大于30%，纯度为94.5%，生物活性约为109个/mL。rIL-1β蛋白佐剂效果评价：取本实验制备的2μg IL-1β蛋白佐剂，并用进口商品化的的IL-1β蛋白为对照，分别与壳聚糖季铵盐水凝胶传递载体（1:1）与甲型H1N1流感裂解病毒抗原（4μg）充分混合，制备喷鼻甲型H1N1流感裂解疫苗，分别在0d、14d免疫Balb/c小鼠，共免疫两次，通过检测其血清中IgG抗体效价、血抑效价，和鼻、肺冲洗液中sIgA效价，初步评价rIL-1β蛋白作为喷鼻疫苗佐剂的有效性。结果证明，所制备的重组IL-1β蛋白产物可以有效增强喷鼻疫苗的免疫效价，具有良好的黏膜佐剂效应。3、喷鼻流感三价裂解疫苗的制备及初步评价：以第一部分、第二部分研究结果为基础，选用壳聚糖季铵盐水凝胶作为疫苗载体，rIL-1β作为佐剂，制备季节性喷鼻流感三价裂解疫苗，并对其喷鼻免疫的效果进行初步评价。以甲型H1N1流感裂解抗原、B型裂解抗原和H3N2裂解抗原分别制备单价疫苗和三价疫苗，使抗原-佐剂的总体积与壳聚糖季铵盐水凝胶的体积比为1:1，不足体积则用PBS溶液补全。以PBS组作为空白组，肌肉注射组为对照组，将以上喷鼻免疫Balb/c小鼠，分别在0d、14d免疫两次。通过ELISA法对免疫前后的小鼠血清中和抗体、IgG抗体及其抗体亚型和鼻冲洗液、肺冲洗液中的sIgA抗体效价进行对比检测，比较三价疫苗与单价疫苗的免疫效价和交叉免疫效果。实验结果发现，喷鼻流感三价疫苗组中动物的血清中IgG抗体各亚型和HI效价显著高于单价疫苗组，且低于肌注对照组；sIgA分泌型抗体效价和IFN-γ、IL-4分泌检测结果均高于三种单价疫苗组和肌注对照组，说明喷鼻流感三价疫苗虽然在引起体液免疫方面不如肌肉注射疫苗，但是能有效且显著地引起黏膜免疫和细胞免疫应答，好于现有的注射流感裂解疫苗。结论：本研究中，从传递系统、黏膜佐剂、抗原类型和免疫应答效果四个方面，对喷鼻流感三价疫苗进行了组合物的筛选和初步评价。研究发现，①在喷鼻流感三价疫苗的小鼠模型中，壳聚糖季铵盐水凝胶作为喷鼻疫苗传递系统的免疫增强效果好于壳聚糖、壳聚糖季铵盐和壳聚糖水凝胶；②IL-1β作为黏膜佐剂对喷鼻疫苗的免疫增强效果好于IL-18、IL-33和水溶性ViE；③流感裂解病毒作为疫苗抗原的免疫效果明显好于灭活全病毒抗原。以上述筛选结果组成喷鼻甲型H1N1流感裂解疫苗，用4μg抗原经0、14d两次免疫后能够诱导较理想的粘膜免疫和系统免疫应答效果。此外，成功制备纯度较高、具有生物活性且能增强喷鼻疫苗免疫效果的人源rIL-1β蛋白佐剂，并通过实验证明其有较好的佐剂效果。以IL-1β为佐剂的喷鼻流感三价裂解疫苗，不仅能够较好的诱导黏膜免疫应答，而且能够诱导体液免疫应答和细胞免疫应答，从而为喷鼻流感三价裂解疫苗研究奠定了良好的基础，同时也为其它喷鼻疫苗的研制提供了实验数据和理论依据。

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-9
英文摘要  9-13
前言  13-18
第一部分甲型 H1N1 流感喷鼻疫苗载体、佐剂和抗原的初步筛选  18-34
  材料与方法  19-24
  结果  24-31
  讨论  31-33
  结论  33-34
第二部分重组 rIL-1β蛋白的制备和纯化  34-58
  材料与方法  34-43
  结果  43-55
  讨论  55-57
  结论  57-58
第三部分喷鼻流感三价裂解疫苗的制备及免疫效果的初步研究  58-72
  材料与方法  58-63
  结果  63-68
  讨论  68-70
  结论  70-72
全文总结  72-73
参考文献  73-78
文献综述  78-84
  参考文献  82-84
实验文章  84-97
个人简历  97-98
致谢  98

喷鼻流感三价裂解疫苗的制备和免疫效果的初步研究

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