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大肠杆菌对胸腺素α原N~α-末端乙酰化修饰的机理研究

作　者: 孙鹏
导　师: 马清钧；吴军
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: N-末端乙酰化修饰胸腺素α原 rimJ rimL rimI N-末端氨基酸序列
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用,它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完善,调节更为精细。这些修饰包括糖基化、N-末端乙酰化、磷酸化、C-末端酰胺化等等。其中N-末端乙酰化是最普遍的共价修饰之一。目前,我们对蛋白质的N-末端乙酰化修饰的认识主要来自真核生物,而在原核细胞中,N-末端乙酰化修饰极其罕见,相关研究更为稀少。蛋白质的Nα-末端乙酰化修饰是由Nα-末端乙酰基转移酶(Nα-terminal acetyltransferases, NATs)将乙酰辅酶A的乙酰基(CH3CO-,分子量约43Da)转移到蛋白质N-末端的Alpha氨基上。蛋白质是否N-末端乙酰化修饰至少取决于两个条件:是否有合适的Nα-末端乙酰基转移酶(NAT),是否有合适的N-末端氨基酸序列。目前确知的原核生物NAT有三种:大肠杆菌的RimI、RimJ和RimL,它们分别负责大肠杆菌核糖体蛋白S18、S5和L12的N-末端乙酰化修饰。关于N-末端氨基酸序列对N-末端乙酰化影响的研究主要集中于真核生物,并且不同于蛋白质N-糖基化修饰位点的氨基酸序列高度保守,我们还不能根据蛋白质N-末端的氨基酸序列来推测此蛋白是否可被N-末端乙酰化修饰。胸腺素α1(Thymosinα1,Tα1)是具有免疫刺激作用的物质,由28个氨基酸组成,分子量3108 Da,等电点4.2,其N-末端的Ser被乙酰化修饰,其前体是胸腺素α原(ProTα)。Tα1具重要的免疫调节作用,在癌症和感染性疾病方面有巨大应用价值,如化学合成的Tα1—“日达仙”已广泛用于治疗病毒性肝炎和肿瘤。但化学法合成Tα1成本高,采用基因工程方法生产重组N-末端乙酰化Tα1,有望降低成本提高产量。本实验室前期研究发现,在利用大肠杆菌表达胸腺素α原(ProTα)时,ProTα有部分乙酰化修饰现象[1]。Fang等[2]在大肠杆菌内表达Tα1-L12融合蛋白时发现,Nα-末端乙酰基转移酶RimJ是Tα1-L12乙酰化的主要修饰酶。为了进一步研究大肠杆菌对ProTαN-末端乙酰化修饰的机理,我们敲除了大肠杆菌DH5α的rimI、rimJ和rimL三个基因,观察ProTα在各缺陷菌中的乙酰化水平。本研究用Red重组的方法构建了rims基因的单敲除、双敲除和三敲除菌株(单敲除菌株3株DH5αΔrimJ、DH5αΔrimL、DH5αΔrimI,双敲除菌株3株DH5αΔrimJΔrimL、DH5αΔrimJΔrimI、DH5αΔrimLΔrimI和三敲除菌株1株DH5αΔrimJΔrimLΔrimI),在缺陷菌中表达ProTα蛋白,经阴离子交换层析纯化后,用RP-HPLC检测相应ProTα的乙酰化水平。结果表明,只要敲除rimJ基因就能使ProTα的乙酰化现象消失;单敲除rimL和rimI基因,以及全敲除此两个基因对ProTα的乙酰化水平无影响。这表明,在天然状态下,RimJ也是ProTα的主要修饰酶。过表达rims基因是否也能得出相同的结论呢?为了探讨过量Rims蛋白对ProTα乙酰化的影响,本研究分别在大肠杆菌DH5α/pBV220-proTα和DH5αΔrimJΔrimLΔrimI/pBV220-proTα中过表达了rims基因,经RP-HPLC检测发现,在野生菌DH5α和三缺陷菌株DH5αΔrimJΔrimLΔrimI中过表达rimL或rimJ都能使ProTα几乎完全乙酰化,而过表达rimI却抑制ProTα的乙酰化。为了进一步研究rimI基因的作用,本研究采用双因素析因设计,考察了“是否过表达rimI”和“诱导时间”两个因素对ProTα乙酰化的影响。在ProTα的RP-HPLC图上,对未乙酰化和乙酰化峰进行面积积分,独立重复三次实验,用SAS统计软件分析相应数据。结果表明,有无rimI的过表达、诱导时间的长短以及两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无rimI过表达,与诱导6h前相比,乙酰化的ProTα所占比例逐渐升高(P<0.0001);在过表达rimI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12h后占37.4%,而在无rimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6h后开始显现(P=0.0007)。本研究初步探讨了N-末端氨基酸序列对大肠杆菌表达的ProTα乙酰化程度的影响。虽然,文献报道在真核细胞中蛋白的N-末端第一位氨基酸是Ser和Ala时,此蛋白被乙酰化的概率较大,如果其后的氨基酸为Met、Gly和Thr时,大约95%的蛋白会被乙酰化修饰;N-末端第二位氨基酸同样影响蛋白质的N-末端乙酰化修饰,酵母中,蛋白质N-末端第一位氨基酸是Ser、Ala、Thr、Met时,如果第二位氨基酸是Glu/Asp会促进乙酰化修饰,而Pro会抑制乙酰化修饰。但是,此规律在不同的物种中有所变化,并且也只是统计学规律,并不能够作为判断蛋白质是否被N-末端乙酰化修饰的标准。为了研究ProTα的第一和第二位氨基酸对其在大肠杆菌中的乙酰化修饰的影响,根据文献报道,本研究构建了10种N-末端氨基酸突变的ProTα,其中第一位Ser突变株4种(ProTαMet1、ProTαThr1、ProTαAla1和ProTαGly1),第二位Asp突变株6种(ProTαVal2、ProTαCys2、ProTαGlu2、ProTαAla2、ProTαPro2和ProTαGly2)。将阴离子交换层析纯化的各ProTα突变体用MALDI-TOF MS检测其分子量,由此分析各突变体的乙酰化情况。结果发现,与天然ProTα相比,将ProTα第一位丝氨酸(Ser)突变为苏氨酸(Thr)后基本不影响ProTα的乙酰化水平;而突变为丙氨酸(Ala)后ProTα的乙酰化水平明显降低,但仍然有少量ProTα被乙酰化修饰;将第一位Ser突变为甘氨酸(Gly),ProTα则不被乙酰化;将第一位Ser突变为甲硫氨酸(Met),则引起ProTα的起始甲硫氨酸切割不完全,而切除起始甲硫氨酸的ProTαMet1也无乙酰化修饰现象。将ProTα的第二位天冬氨酸(Asp)突变为谷氨酸(Glu)或缬氨酸(Val)时,ProTα仍有乙酰化现象,但乙酰化水平明显降低;将第二位的Asp突变为缬氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)时可引起ProTα不同程度的N-末端降解,其中将第二位Asp突变为Cys、Pro时几乎没有完整的ProTα存在,ProTαN-末端突变后引起的N-末端降解的机理还不明确,值得进一步深入研究。综上所述,ProTα在大肠杆菌DH5α中表达时可获得N-末端乙酰化修饰,该过程主要由RimJ催化。过量的RimL或RimJ可使ProTα几乎完全被乙酰化修饰,而过量的RimI却抑制ProTα的乙酰化修饰。初步研究发现,ProTα的N-末端氨基酸序列不同程度的影响其乙酰化水平,其规律与真核生物的有相似之处。本研究为原核生物N-末端乙酰化修饰的机理研究提供了良好的模型,丰富了数据资料,为以后的深入研究提供了线索。

大肠杆菌对胸腺素α原N~α-末端乙酰化修饰的机理研究

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