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高原高寒环境因素对内皮细胞的损伤作用及其保护作用化合物研究

作　者: 卫华
导　师: 汪海; 刘嘉瀛; 杨丹凤
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 低温低氧低温低氧复合血管内皮细胞纳他卡林同型半胱氨酸
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究背景：我国高原面积广大，且大多处于边境地区，战略意义十分重要。高原特殊的地理环境和地貌特征造成了高原地区寒冷、低氧双重胁迫的环境特点。高原环境不但损害人体健康，更影响高原部队平战时的机动性和作训能力，因此解决高原官兵健康问题是提高我军战斗力的必要环节。平原人初入高原时，由于氧气浓度骤减，机体发生了一系列的病理性变化，易患高原肺水肿、高原脑水肿，而久居高原的人由于长期缺氧代偿反应，易患肺动脉高压、高原性心脏病，而这些疾病的始动因子是内皮细胞的紊乱。另外，在高原高寒的环境下，野外作业时间可能引起全身性低体温（35～28℃），表现为外周血收缩、血液灌流减少、四肢易患冻伤，而此时最先受到损伤的仍是内皮细胞。因此保护内皮细胞，逆转内皮细胞功能紊乱成为防治高原疾病的新对策。纳他卡林（natakalim，Nat）是可高选择性的激活KATPSUR2B/Kir6.1亚型的先导化合物。前期研究已表明KATP的激活在高原肺水肿、高原脑水肿的防治上具有积极的作用，目前已知纳他卡林可以通过逆转内皮功能紊乱从而改善压力超负荷致心力衰竭，而关于纳他卡林对低氧所致的内皮细胞损伤的保护作用与保护机制的研究还甚少。因此研究低温、低氧及复合条件对机体的影响及其机制，并研究新型内皮细胞保护药物对抗低氧损伤的效果及其机理，具有重要的意义。研究目的：研究低温（28℃）、低氧（3%O2）、低温低氧复合三种条件下大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells，RAEC）的损伤规律，用2×2析因分析的方法阐明复合损伤与单因素损伤的区别及复合条件下的主要影响因素，为进一步认识高原高寒环境损伤提供理论依据。另外，针对ATP敏感性钾通道SUR2B/Kir6.1亚型选择性开放剂——纳他卡林，以急性低氧和高同型半胱氨酸（homocystein，HCY）作为损伤因素，研究药物的内皮细胞的保护作用及其机制。研究方法：采用主动脉血管片贴壁培养法，体外培养SPF级雄性Wistar大鼠胸主动脉内皮细胞。用MTT法测定细胞存活率、倒置显微镜观察细胞形态，确定低温损伤的有效作用时间。以21%O2、28℃培养30h为条件，研究低温对内皮细胞的损伤作用；以3%O2、37℃培养30h为条件研究低氧对内皮细胞的损伤作用；在研究低温低氧复合作用时，将内皮细胞分为正常对照组（21%O2、37℃）、低温模型组（21%O2、28℃）、低氧模型组（3%O2、37℃）、复合模型组（3%O2、28℃），同时孵育内皮细胞30h。用MTT法测定细胞存活率、硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）的释放、RT-PCR法检测细胞间粘附因子-1（ICAM-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、内皮素-1（ET-1）基因的表达水平；Hoechst33258和TUNEL法检测细胞凋亡；Western Blot法检测HIF-1α蛋白表达水平；通过透射电镜观察细胞超微结构。用析因分析的方法，阐明复合损伤与单因素损伤的区别，确定复合条件下的低温、低氧对内皮细胞影响的主次效应。在研究纳他卡林对低氧所致RAEC损伤的保护作用中，将细胞分为正常对照组、低氧模型组、纳他卡林低、中、高剂量组，格列本脲拮抗组。用MTT法测定细胞存活率、硝酸还原酶法检测NO的释放、黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活力、RT-PCR法检测ICAM-1、VEGF、ET-1的基因表达水平；ELISA法测定ICAM-1、VEGF蛋白的表达水平。在研究纳他卡林对高HCY致RAEC损伤的保护作用中，用Realtime-PCR法检测血管细胞黏附因子（VCAM-1）、单核细胞趋化因子（MCP-1）和ICAM-1基因的表达水平。研究结果：1.血管内皮细胞的培养和鉴定采用主动脉血管片贴壁的方法，培养出大鼠主动脉内皮细胞，经CD31免疫荧光鉴定，内皮细胞阳性率98%以上。2.寒冷对血管内皮细胞的影响根据细胞存活率的测定和形态学的观察，确定30h为低温损伤的有效作用时间，因此将28℃孵育细胞30h作为研究低体温损伤的体外模型。研究发现低温具有明显的降低细胞增殖率，抑制细胞NO释放的作用，此外，低温在细胞凋亡和通透性方面具有一定的抑制作用，而在炎性因子的释放、内皮素基因表达方面有一定的促进作用，低温时可见细胞内质网发生扩张，呈大泡状。3.高原低氧对内皮细胞的影响低氧可促进细胞凋亡、抑制NO释放，增强炎性因子和内皮素基因表达，可导致血管通透性增高，HIF-1α表达量增多，低氧时细胞超微结构的改变表现为线粒体肿胀、断裂，质膜小泡增多。4.低温低氧复合因素对内皮细胞的影响低温低氧复合因素在细胞存活率、内皮活性因子的释放（NO、ET-1）、炎性因子表达、HIF-1α蛋白表达、细胞凋亡、细胞器变化方面存在着交互作用，在通透性方面没有交互作用。具体表现为：当内皮细胞长至60%后进行干预，复合组细胞存活率与对照组、低温组、低氧组相比均有所下降，低温低氧对细胞存活率的影响具有正交互效应，在复合条件下低温为主要因素，对细胞存活率的影响更为显著。当内皮细胞长至100%后进行干预，复合组的细胞存活率与对照组、低温组相比有所降低，但与低氧组相比略有升高，低温低氧对细胞存活率的影响无交互效应，在复合条件下仅低氧对细胞存活率的具有显著性影响。在NO释放方面，复合组的细胞NO的释放量与对照组、低温组、低氧组相比均有大幅下降，低温低氧对细胞NO的释放量的影响具有正交互效应，在复合条件下低温为主要因素，对细胞NO释放量的影响更为显著。在细胞凋亡方面，低氧和复合条件下，均有细胞凋亡现象，且复合组比低氧组凋亡细胞少；提示在复合条件下，低温低氧具有负交互效应，低氧为主要影响因素，低温对细胞凋亡具有一定的保护作用。在炎性因子表达方面，复合组的细胞ICAM-1mRNA的表达量与对照组、低温组相比均有所升高，但比低氧组的表达量低，低温低氧对细胞ICAM-1基因表达的影响具有负交互效应，在复合条件下低氧为主要因素，对细胞炎性因子表达的影响更为显著。在细胞通透性方面，复合组的细胞VEGF mRNA的表达量与对照组、低温组相比显著性升高，比低氧组的表达量显著降低，低温低氧对细胞VEGF基因表达的影响无显著性交互效应，在复合条件下低氧为主要因素，对细胞VEGF基因表达具有极显著的影响。在ET-1基因表达方面，复合组的细胞ET-1mRNA的表达量与对照组、低温组相比均有所升高，但比低氧组的表达量低，低温低氧对细胞ET-1基因表达的影响具有负交互效应，在复合条件下低氧为主要因素，对细胞ET-1基因表达的影响更为显著。在低氧诱导因子（HIF-1α）的表达方面，复合组细胞HIF-1α蛋白表达量与对照组、低温组相比极显著性升高，与低氧组相比略有降低，低温低氧对细胞HIF-1α蛋白的表达量的影响具有负交互效应，在复合条件下低氧为主要因素，对细胞HIF-1α蛋白表达的影响更为显著。在细胞超微结构方面，低温低氧复合条件出现了线粒体发肿胀、断裂，内质网扩张等超微结构的损伤，与单因素损伤相比具有一定的加成作用。总之在复合损伤中，低温在细胞增殖力和NO释放量方面为主要影响因素，与低氧复合具有正交互作用。低氧在细胞凋亡、炎性因子的释放、通透性改变、HIF-1α的表达方面为主要影响因素，低温低氧复合时具有拮抗作用，即低温具有一定的低氧损伤保护作用。5.纳他卡林对低氧致内皮细胞损伤的保护作用氧气浓度为3%的条件下培养内皮细胞24h，与对照组相比细胞存活率降低了22.3%，NO释放量下降了39.9%，SOD活力降低了61.8%，ICAM-1、ET-1、VEGF基因表达量均显著上调(P<0.05, P<0.01)；低氧干预12h后ICAM-1、VEGF蛋白表达量显著上调(P<0.05, P<0.01)。0.1、1、10μmol/L纳他卡林与内皮细胞孵育8h，在氧气浓度为3%的条件下培养内皮细胞24h后，与模型组相比，纳他卡林三个剂量组均可逆转低氧所致的血管内皮细胞功能改变，包括提高内皮细胞生存活力和NO的释放水平、增强SOD活力、显著抑制低氧所致ICAM-1、ET-1、VEGF基因过度表达(P<0.05, P<0.01)及ICAM-1、VEGF蛋白的高表达（P<0.05, P<0.01）。使用格列本脲作为拮抗剂预孵育内皮细胞6h，再用10μmol/L纳他卡林孵育8h后，置于氧浓度为3%的培养箱中培养24h，在细胞存活率、NO的释放和SOD活性方面，格列本脲可显著逆转纳他卡林的保护作用（P<0.01）。6.纳他卡林对高同型半胱氨酸致内皮细胞损伤的保护作用0.1mmol/L同型半胱氨酸孵育大鼠胸主动脉内皮细胞6h，与正常对照组相比， VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因表达水平均显著上调。0.001,0.01,0.1,1,10μmol/L纳他卡林与内皮细胞共孵育8h，再给予0.1mmol/LHCY孵育6h后，与模型组相比，0.001～10μmol/L纳他卡林均可显著抑制高同型半胱氨酸所致VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因过度表达，但未呈现明显的剂量依赖效应，0.001μmol/L纳他卡林即可对高同型半胱氨酸致内皮细胞炎性因子的过度表达起到抑制作用，说明纳他卡林具有强效的内皮保护效果。结论：低温低氧复合损伤与单因素损伤不同，在细胞增殖、NO释放、炎症因子表达、内皮素基因表达、细胞凋亡、HIF-1α蛋白表达方面具有交互效应，在VEGF基因方面无交互作用。低温低氧复合在抑制细胞增殖、抑制NO的释放方面具有正交互效应，而在炎性因子表达、ET-1基因表达、细胞凋亡、HIF-1α蛋白表达方面，具有负交互效应，即低温对低氧损伤起到了一定的保护作用。以KATP为靶点的先导化合物纳他卡林可逆转低氧及高同型半胱氨酸诱导的内皮细胞功能紊乱，具有强效的内皮保护作用。

全文目录

目录  3-6
略语表  6-8
中文摘要  8-13
Abstract  13-19
前言  19-23
实验材料  23-26
  1 动物  23
  2 主要药品及试剂  23-24
  3 主要仪器  24-26
实验方法  26-36
  1 组织贴块法分离培养 RAEC  26
  2 倒置相差显微镜观察细胞形态  26
  3 CD3 1 免疫荧光鉴定 RAEC  26-27
  4 MTT法检测细胞存活率  27
  5 硝酸还原酶法测定NO的释放  27
  6 Hoechst 33258法检测细胞凋亡  27-28
  7 TUNEL法检测细胞凋亡  28
  8 透射电镜观察细胞超微结构的变化  28-29
  9 PCR法检测基因表达  29-32
  10 Western Blot法检测HIF-1α的表达  32-33
  11 ELISA法检测ICAM-1、VEGF蛋白表达  33-34
  12 实验分组  34-35
  13 统计学处理  35-36
实验结果  36-79
  第一章低氧寒冷复合环境因素对血管内皮细胞的损伤作用  36-67
    第一节血管内皮细胞的培养与鉴定  36-38
      1 倒置相差显微镜对内皮细胞形态的观察  36
      2 CD31 免疫荧光鉴定 RAEC 结果  36-37
      小结  37-38
    第二节寒冷环境因素对血管内皮细胞的损伤作用  38-45
      1 低温对内皮细胞损伤模型的建立  38-39
      2 低温对内皮细胞生存率的影响  39-41
      3 低温对内皮细胞凋亡的影响  41
      4 低温对内皮细胞超微结构的影响  41-42
      5 低温对内皮细胞NO释放的影响  42-43
      6 低温对内皮细胞ICAM-1、ET-1、VEGF基因表达的影响  43-44
      小结  44-45
    第三节低氧环境因素对血管内皮细胞的损伤作用  45-50
      1 低氧对内皮细胞生存率的影响  45
      2 低氧对内皮细胞凋亡的影响  45-46
      3 低氧对内皮细胞超微结构的影响  46
      4 低氧对内皮细胞NO释放的影响  46-47
      5 低氧对内皮细胞ICAM-1、ET-1、VEGF基因表达的影响  47-48
      6 低氧对内皮细胞HIF-1α蛋白表达的影响  48-49
      小结  49-50
    第四节低氧寒冷复合环境因素对血管内皮细胞的损伤作用  50-67
      1 低温低氧复合因素对内皮细胞生存率的影响  50-53
      2 低温低氧复合因素对内皮细胞凋亡的影响  53
      3 低温低氧复合因素对内皮细胞NO释放的影响  53-55
      4 低温低氧复合因素对内皮细胞炎性因子表达的影响  55-57
      5 低温低氧复合因素对内皮细胞通透性的影响  57-59
      6 低温低氧复合因素对内皮细胞ET-1基因表达水平的影响  59-62
      7 低温低氧复合因素对内皮细胞HIF-1α蛋白表达的影响  62-64
      8 低温低氧复合因素对内皮细胞超微结构的影响  64-66
      小结  66-67
  第二章 ATP 敏感性钾通道 SUR2B/Kir6.1 亚型选择性开放剂对内皮细胞的保护作用  67-79
    第一节纳他卡林对低氧致内皮细胞损伤的保护作用  67-75
      1 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞生存活力的影响  67-68
      2 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞 NO 释放量的影响  68-69
      3 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞氧化损伤的影响  69
      4 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞 ICAM-1 基因表达的影响  69-71
      5 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞 ET-1 基因表达的影响  71
      6 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞 VEGF 基因表达的影响  71-72
      7 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞 ICAM-1 蛋白表达的影响  72-73
      8 纳他卡林对低氧条件下内皮细胞 VEGF 蛋白表达的影响  73-74
      小结  74-75
    第二节纳他卡林对同型半胱氨酸致内皮细胞损伤的保护作用  75-79
      1 纳他卡林对同型半胱氨酸诱导内皮细胞 VCAM-1 基因表达水平的影响  75-76
      2 纳他卡林对同型半胱氨酸诱导内皮细胞 ICAM-1 基因表达水平的影响  76-77
      3 纳他卡林对同型半胱氨酸诱导内皮细胞 MCP-1 基因表达水平的影响  77-78
      小结  78-79
讨论  79-85
全文总结  85-86
参考文献  86-91
个人简历  91-92
致谢  92-93

高原高寒环境因素对内皮细胞的损伤作用及其保护作用化合物研究

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