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受TGF-β调节的microRNA在内皮细胞中的功能及其作用机制

作　者: 王俊
导　师: 杨晓
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: miR-8029 TGF-β Smad4 血管形成 PTEN
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


TGF-β（Transforming growth factor-β）信号通路对生理和病理情况下的血管形成过程都发挥重要的作用。人类的一种常染色体疾病，遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia, HHT)，被发现主要是由于TGF-β通路分子突变引起的。对基因敲除小鼠的研究也证实无论是这个信号通路的配体，如TGF-β1；受体，如TGF-βII型受体（TβRII），TGF-βI型受体activin受体样激酶（activin receptor-like kinase1，ALK1），III型受体endoglin；或胞内信号介导者如Smad1、 Smad4,、Smad5敲除以后小鼠都会由于严重的血管缺陷死于胚胎期。TGF-β可以直接调节参与血管形成的效应分子的表达，比如一些胞外基质相关分子。我们之前的工作通过对小鼠模型的研究，发现Smad4可以和Notch信号通路共同调节黏附分子N-cadherin的转录，影响内皮细胞和周细胞的黏附，从而影响血管的成熟与稳定。然而，要全面理解TGF-β调节血管形成的分子机制仍需要深入的研究。microRNAs (miRNA)是一类18-25碱基的非编码小RNA，可以通过抑制翻译或促进mRNA降解来负调节基因表达发挥生物学功能。近几年里有一些对血管形成重要的microRNA被逐渐发现。miR-126、miR-23-27-24簇、miR-424、miR-130a、miR-296和miR-210促进血管形成。而miR-17-92簇、miR-214、miR-200b、miR-221、miR-222可以抑制血管形成。其中有一些可响应VEGF、血清、血流机械力等因素，通过作用一系列靶分子，调节内皮细胞增殖、迁移，细胞周期，从而调节血管形成。一些microRNA被发现受到TGF-β信号的调控。然而内皮细胞中可以调控血管形成的受TGF-β调节的microRNA还未见报道。本研究旨在寻找内皮细胞中受TGF-β调节的microRNA，并研究其对血管形成的影响及作用机制。我们主要进行了三部分的工作。第一是在内皮细胞中筛选验证受TGF-β信号通路调节的miRNA。第二是研究这些miRNA对内皮细胞功能的影响。第三是筛选验证该miRNA的靶分子。我们发现miR-8029在各物种间高度保守,在内皮细胞中丰度很高，在内皮细胞中会被TGF-β上调。用鸡胚绒毛膜血管形成模型我们发现miR-8029可以明显促进血管形成，介导了TGF-β对血管形成的促进作用。我们检测了miR-8029对一系列细胞功能的影响，确定miR-8029主要促进内皮细胞的迁移和成管的功能。我们发现磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）可以显著被miR-8029下调。PTEN敲除会促进内皮细胞的迁移成管并伴随p-AKT升高，和miR-8029的效应一致。用p-AKT抑制剂LY294002处理会逆转miR-8029对内皮迁移成管及其对血管形成的影响，也证明了miR-8029的确是通过激活Akt促进血管形成的。综上所述，我们发现受Smad4/TGF-β调节的miR-8029，可以通过抑制PTEN，活化Akt促进内皮细胞的迁移和成管，从而促进血管形成。这是第一次发现一种TGF-β通过miRNA调节血管形成的机制。也是首次阐述miR-8029在血管形成中的作用。另外我们展示了在内皮细胞中TGF-β可以通过上调miRNA激活Akt信号通路。有报道发现一些肿瘤中miR-8029表达异常，miR-8029在肿瘤血管中是否有作用，可能值得未来进一步的研究。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-9
第一章 前言  9-29
  一、 血管形成概况  9-21
    1、 血管形成简介  9-13
    2、调控血管发育的信号通路  13-21
  二、miRNA 在血管内皮中的研究  21-28
    1、 microRNA 简介  21-22
    2、 microRNA 在血管发育中的研究进展  22-24
    3、 microRNA 在肿瘤血管形成中的作用  24-25
    4、 受 TGF-β调节的 microRNA 的研究进展  25-28
  三、研究目的、内容和意义  28-29
第二章 材料方法  29-36
  一、 实验动物  29
  二、 基因组 DNA 的提取和基因型鉴定  29-30
  三、 胚胎内皮细胞的分离培养  30
  四、 获得逆转录病毒介导的 siRNA 稳定转染细胞  30-31
  五、 人脐静脉内皮细胞的分离培养  31
  六、 细胞 RNA 的提取  31
  七、 Northern Blot 检测 miRNA  31-32
  八、 逆转录反应  32
  九、 Real-time PCR  32-33
  十、 蛋白质印迹（Western blot）  33
  十一、 载体构建  33-34
  十二、荧光素酶报告实验  34
  十三、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡  34-35
  十四、细胞迁移实验  35
  十五、内皮细胞成管实验  35
  十六、鸡胚绒毛膜实验  35-36
第三章 TGF-β调节内皮细胞中 miR-8029 的表达  36-42
  一、 内皮细胞中受 TGF-β调节的 microRNA 的筛选  36-39
  二、 TGF-β 以 Smad4 依赖的方式调节内皮细胞中 miR-8029 表达  39-42
第四章 miR-8029 介导了 TGF-β诱导的血管形成  42-50
  一、 鸡胚绒毛膜中 miR-8029 介导 TGF-β诱导的血管形成  42-44
  二、 miR-8029 促进内皮细胞迁移和成管  44-50
第五章 miR-8029 通过靶向 PTEN 促进血管生成  50-55
第六章 讨论  55-57
结论  57-58
参考文献  58-65
在读期间发表论文及个人简历  65-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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