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MEK/ERK信号通路在缺锌致海马神经细胞损伤中的作用及其机制研究

作　者: 庞伟
导　师: 郭长江; 蒋与刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 缺锌海马神经细胞凋亡 MEK/ERK信号转导表观遗传修饰
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

锌是人体必需微量元素，具有维持生物膜的正常结构和功能、维持细胞正常形态、生长和发育等多种生物学作用，其中锌与学习记忆的关系及相关机制研究备受关注。本研究在课题组前期工作的基础上，探讨了在缺锌致海马神经细胞损伤过程中MEK/ERK信号通路及其表观遗传修饰的变化。主要完成了以下几方面工作：1、探讨了缺锌对原代培养大鼠海马神经细胞损伤与凋亡的影响。原代培养乳鼠海马神经细胞分为4组。即Control组（不加任何处理因素）、TPEN组（2μmol/LTPEN作用24h）、TPEN＋5μmol/L Zn组（同时加入2μmol/L TPEN及5μmol/L的ZnSO4作用24h）和TPEN＋50μmol/L Zn组（同时加入2μmol/LTPEN及50μmol/L的ZnSO4作用24h）。观察海马神经细胞的存活率、坏死率、凋亡率及细胞上清液LDH活性的变化；应用Western blot技术检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达。结果显示：(1)2μmol/L TPEN作用24h后，海马神经存活率明显降低，与对照组相比，差异具有显著性(P<0.05);5μmol/L Zn和50μmol/L Zn均可显著抑制TPEN诱导的细胞存活率降低，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(2)2μmol/L TPEN作用24h后，海马神经细胞上清液中LDH活性明显升高，与对照组相比，差异具有显著性(P<0.05)；5μmol/L Zn和50μmol/L Zn均能够明显降低细胞上清液中LDH活性，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(3)2μmol/L TPEN作用24h后，海马神经细胞坏死率、凋亡率明显增加，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；5μmol/L Zn和50μmol/L Zn均可明显降低海马神经细胞坏死率及凋亡率，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(4)2μmol/L TPEN作用24h可明显抑制海马神经细胞Bcl-2蛋白的表达，与对照组相比，差异具有显著性(P<0.05)；5μmol/L Zn和50μmol/L Zn均明显抑制TPEN诱导的海马神经细胞Bcl-2蛋白的表达降低，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(5)2μmol/L TPEN作用24h后，海马神经细胞Bax及Caspase-3蛋白的表达明显升高，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；联合应用5μmol/L Zn或50μmol/L Zn均能明显抑制Bax及Caspase-3蛋白表达，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。2、探讨了缺锌对海马神经细胞MEK/ERK通路的影响。实验分组同上。采用Western blot技术检测MEK/ERK信号通路的关键信号分子Raf-1、pMEK及pERK蛋白表达。采用RT-PCR检测了MEK/ERK信号通路上游信号分子NMDA受体的mRNA表达；荧光分光光度法检测海马神经细胞内[Ca2+]i及ROS水平。采用Westernblot技术检测MEK/ERK信号通路下游信号分子CREB的磷酸化水平、BDNF蛋白及mRNA的表达。结果显示：(1)用2μmol/L TPEN处理神经细胞24h后，Raf-1、pMEK及pERK蛋白表达均明显下降，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；5μmol/L Zn和50μmol/L Zn均明显抑制TPEN诱导的海马神经细胞Raf-1、pMEK及pERK蛋白表达的降低，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(2)用2μmol/L TPEN处理海马神经细胞24h，可明显促进NMDA三种亚型中NR1及NR2BmRNA的表达，抑制NR2A mRNA的表达，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；5μmol/L Zn和50μmol/L Zn均明显抑制TPEN诱导的海马神经细胞NR1及NR2BmRNA表达的上调及NR2A mRNA表达的下调，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(3)用2μmol/L TPEN处理海马神经细胞24h后，细胞内[Ca2+]i及ROS水平明显升高，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；联合应用5μmol/L Zn或50μmol/L Zn均能明显抑制细胞内[Ca2+]i及ROS水平升高，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(4)用2μmol/L TPEN处理神经细胞24h，可明显抑制pCREB、BDNF蛋白及mRNA的表达，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；联合应用5μmol/L Zn或50μmol/L Zn均能明显促进pCREB、BDNF蛋白及mRNA的表达，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。3、探讨了MEK/ERK信号通路激动剂NGF及抑制剂U0126对海马神经细胞凋亡率及Bcl-2/Bax、Caspase-3蛋白表达的影响。原代培养乳鼠海马神经细胞分为3组，分别是：(1) TPEN组：2μmol/LTPEN处理海马神经细胞24h。(2) TPEN+U0126组：用10μmol/L U0126预孵育海马神经细胞30min，再用TPEN处理24h。(3)TPEN+NGF组：用100ng/mlNGF预孵育海马神经细胞30min，再用TPEN处理24h。采用Hochest染色的方法检测细胞凋亡率；Western Blot技术检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达。结果显示：(1)用U0126预处理海马神经细胞后，TPEN诱导的海马神经细胞凋亡率增加了1.8倍；用NGF预处理海马神经细胞后， TPEN诱导的海马神经细胞凋亡率下降了1.4倍，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(2) U0126预处理海马神经细胞，可显著促进Caspase-3蛋白的表达；NGF预处理海马神经细胞，则可显著抑制Caspase-3蛋白的表达，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(3) U0126和NGF预处理对Bcl-2和Bax蛋白表达无明显影响(P>0.05)。4、探讨了缺锌对海马神经细胞表观遗传修饰的影响。实验分为Control组、TPEN组（2μmol/LTPEN）、TPEN＋5μmol/L Zn组和TPEN＋50μmol/L Zn组，处理同前。采用免疫酶学法检测海马神经细胞核内HDAC的活性；RT-PCR的方法检测DNMT1、DNMT3a及DNMT3b以及组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2及HDAC3mRNA的表达。结果显示：(1)用2μmol/L TPEN处理神经细胞24h，HDAC活性明显升高，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；5μmol/L Zn和50μmol/L Zn能够显著抑制TPEN诱导的HDAC活性的升高，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(2)用2μmol/L TPEN处理神经细胞24h后，HDAC2mRNA的表达明显增加，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；而联合应用5μmol/L Zn或50μmol/LZn能够显著抑制HDAC2mRNA的表达，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)；用2μmol/L TPEN处理神经细胞24h，对HDAC1及HDAC2mRNA表达无明显影响，与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。(3)用2μmol/L TPEN处理神经细胞24h后，DNMT1mRNA的表达明显增加，DNMT3a mRNA的表达明显降低，与对照组比较，差异具有显著性(P<0.05)；而DNMT3b mRNA的表达无明显变化。5、探讨了MEK/ERK信号通路对海马神经细胞组蛋白去乙酰化的影响。实验分为TPEN组、TPEN+U0126组、TPEN+NGF组，处理同前。采用免疫酶学法检测细胞核内HDAC的活性；RT-PCR技术检测HDAC2mRNA的表达。结果显示：(1)U0126预处理海马神经细胞，可明显增加TPEN诱导的HDAC活性升高，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)；NGF预处理海马神经细胞，则可显著抑制TPEN诱导的HDAC活性的升高，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。(2) U0126预处理海马神经细胞，可显著促进HDAC2mRNA的表达；NGF预处理海马神经细胞，则可显著抑制HDAC2mRNA的表达，与TPEN组比较，差异具有显著性(P<0.05)。综上所述，MEK/ERK信号通路表达异常及其组蛋白乙酰化修饰改变，可能是缺锌致海马神经细胞损伤的重要机制，适量补锌可通过调控MEK/ERK信号通路，减缓海马神经细胞损伤。本研究结果为阐明缺锌致海马损伤的分子机制以及通过补锌干预防治缺锌相关认知功能障碍提供了新思路和科学依据。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-14
前言  14-17
  研究内容  15-16
  技术路线  16-17
第一部分缺锌对原代培养大鼠海马神经细胞损伤与凋亡的影响  17-33
  一、缺锌对海马神经细胞的损伤作用  17-33
    1 材料与方法  17-24
    2 结果  24-31
      2.1 海马神经细胞纯度鉴定结果  24-25
      2.2 缺锌对海马神经细胞形态的影响  25
      2.3 缺锌对海马神经细胞存活率的影响  25-26
      2.4 缺锌对海马神经细胞上清液中 LDH 活性的影响  26-27
      2.5 缺锌对海马神经细胞坏死率的影响  27
      2.6 缺锌对海马神经细胞凋亡的影响  27-29
      2.7 缺锌对海马神经细胞 Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响  29-31
      2.8 缺锌对海马神经细胞 Caspase-3 蛋白表达的影响  31
    3 讨论  31-33
第二部分 MEK/ERK 通路在缺锌致海马神经细胞损伤中的作用  33-53
  一、缺锌对海马神经细胞 MEK/ERK 通路的影响  33-46
    1 材料与方法  33-38
    2 结果  38-46
      2.1 缺锌对海马神经细胞Raf-1、pMEK、pERK蛋白表达的影响  38-40
      2.2 缺锌对海马神经细胞NR1、NR2A、NR2B mRNA表达的影响  40-42
      2.3 缺锌对海马神经细胞内[Ca~（2+）]i的影响  42-43
      2.4 缺锌对海马神经细胞内ROS水平的影响  43-44
      2.5 缺锌对海马神经细胞pCREB蛋白表达的影响  44
      2.6 缺锌对海马神经细胞BDNF蛋白及mRNA表达的影响  44-46
  二、NGF 及 U0126 对海马神经细胞凋亡的影响  46-53
    1 材料与方法  46
    2 结果  46-49
      2.1 U0126、NGF 对海马神经细胞凋亡率的影响  46-47
      2.2 U0126、NGF 对海马神经细胞 Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响  47-48
      2.3 U0126、NGF 对海马神经细胞 Caspase-3 蛋白表达的影响  48-49
    3 讨论  49-53
第三部分 MEK/ERK 通路在缺锌致海马神经细胞表观遗传修饰改变中的作用  53-66
  1 材料与方法  53-57
  2 结果  57-63
    2.1 缺锌对海马神经细胞核内 HDAC 活性的影响及锌调控  57-58
    2.2 缺锌对海马神经细胞 HDAC1、HDAC2 及 HDAC3 mRNA 表达的影响  58-61
    2.3 NGF 及 U0126 对海马神经细胞核内 HDAC 活性的影响  61-62
    2.4 NGF 及 U0126 对海马神经细胞 HDAC2 mRNA 表达的影响  62
    2.5 缺锌对海马神经细胞 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA 表达的影响  62-63
  3 讨论  63-66
结论  66-67
缺锌致海马神经细胞损伤的可能机制图  67-68
参考文献  68-77
文献综述  77-87
  参考文献  82-87
附在学期间发表的论文全文  87-94
个人简历  94-95
致谢  95

MEK/ERK信号通路在缺锌致海马神经细胞损伤中的作用及其机制研究

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