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miR-200b对外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响

作　者: 陈晨
导　师: 张毅
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 树突状细胞 miR-200b 发育
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

MicroRNA (miRNA)是一种内源性、大小约为19~25个碱基的非编码单链小RNA,其作用机制是通过其反义链与靶mRNA分子完全或不完全互补结合、切割同源性靶mRNA分子或抑制其翻译,导致特异性靶基因沉默来调控基因表达[1-2]。研究表明,miRNA在物种间具有高度的保守性、细胞或组织特异性、时序性和位相性,即在特定的细胞或组织、时间、发育阶段才会表达,这决定了组织和细胞功能的特异性,对组织的发育起着重要的作用,因此成为目前研究的热点[3]。树突状细胞(dentritic cells, DCs)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞(antigen process cell, APC),从造血干细胞发育而来,DC的发育和分化具有鲜明的时序性和位相性[4-5],因此,非常适合作为靶细胞研究miRNA对其发育、增殖、分化与凋亡的调控。目前有关miRNA对DC发育的影响研究甚少,为此我们通过生物信息学预测发现miRNA200b(miR-200b)可能对DC的发育产生影响。进一步检测外周血单核细胞分化为DC的不同阶段miR-200b的表达,结果显示miR-200b在分化过程中变化显著。结合我们初步的实验结果,有理由推测miR-200b可能对DC的发育产生影响,为此我们设计了miR-200b对外周血单核细胞来源DC发育影响的研究课题,旨在阐明miR-200b对DC发育的调控及其机制,为深入探讨DC的免疫调控作用提供理论与实验依据。首先,为建立稳定的外周血CD14~+单核细胞来源DC培养体系,通过免疫磁珠法分离外周血CD14~+单核细胞,比较IMDM和RPMI 1640两种培养基结合细胞因子GM-CSF+IL-4,诱导CD14~+单核细胞向DC分化是否存在差异,从形态、表型和功能三个方面进行鉴定。研究结果表明,两种培养基诱导所得DC在形态上无显著差异, iDC与mDC都具备未成熟与成熟DC的典型特征,即未成熟的iDC呈圆球状,而经过LPS诱导刺激后的mDC细胞表面具有明显的不规则突起;流式细胞仪检测DC的吞噬能力,结果显示, IMDM培养的DC与用RPMI 1640培养的DC具有相似的吞噬能力,在未成熟状态下吞噬效率高达90%以上,而成熟后的吞噬效率则低于50%。进一步对诱导获得DC的细胞表型进行检测,发现CD14和CD83的表达亦无显著差异,但IMDM培养的DC其CD1a表达明显降低,分别为IMDM-iDC(32.34%±9.02%)和IMDM-DC(21.04%±6.33%);RPMI-1640培养体系的CD1a表达呈高水平,分别为1640-iDC(85.58%±4.26%)和1640-DC(87.68%±5.83%)。经过LPS刺激成熟后,作为树突状细胞成熟的表面标志CD83表达亦变化显著,RPMI 1640-mDC表达高水平CD83(86.62%±1.37%),而IMDM-mDC则为(64.68%±5.26%);利用MLR体系对诱导所获DC进行功能检测,即其刺激T细胞增殖能力,结果表明,无论是IMDM还是RPMI1640培养的iDC和mDC,它们刺激T细胞增殖的能力均存在显著差异。IMDM-iDC和RPMI 1640-iDC的cpm值分别为277.2±25.79和3170±454.12;而IMDM-mDC和RPMI 1640-mDC的cpm值分别为1402.6±128.07和5274.4±426.26。在这两种培养体系中,iDC刺激T细胞增殖的能力均显著低于mDC,而用RPMI 1640-mDC对T细胞的刺激能力又显著高于IMDM-mDC,且随着刺激细胞浓度梯度的降低, T细胞增殖能力也逐渐减低。由于不同细胞因子对DC的发育与功能起非常重要的调控作用,为此我们利用悬浮芯片法检测MLR体系中细胞因子的表达,结果表明,IMDM培养条件下的活化的T细胞表达较高的免疫抑制性因子IL-10(56.67±33.41 pg/mL),以及IL-6(315.48±15.43 pg/mL)和IL-8(17300.76±2273.89 pg/mL),但作为DC成熟标志的IL-12却无法检测到;而RPMI1640培养体系则高表达IL-12(5658.09±540.46 pg/mL),提示不同培养体系可获得功能不同的DC。为进一步深入研究DC的发育分化机制,我们采用RPMI1640培养基进行miRNA对DC发育分化影响的实验。其次,通过生物信息学预测发现miR-200b可能对DC的发育分化产生影响。miR-200家族根据不同功能区和“种子区”序列,分为miR-200a/miR-141和miR-200b/miR-200c/miR-429两个亚家族;而根据不同的基因组定位,miR-200家族又分为miR-200a/miR-200b/miR-429和miR-200c/miR-141两个基因簇[6]。已有研究结果表明,miR-200家族功能呈多样性,其中miR-200b在许多肿瘤中存在异常表达[7-9],对其生物学功能检测结果显示,在膀胱癌细胞系T24中过表达miR-200b可使细胞形态发生显著改变,细胞失去伪足样突起,形状变得不规则;进一步实验结果证明转染miR-200b后的肿瘤细胞迁移能力也显著下降。利用生物信息学软件预测miR-200b靶基因,发现其靶基因Jagged2、WISF1、WASF-3、ZEB1和ZEB2在DC中均有表达,且这些靶基因在3’-UTR均有miR-200b的作用靶点。结合DC的发育分化过程和形态特征与预测结果具有相似性,因此我们有理由推测DC可能是miR-200b的作用靶点。为此,我们取不同培养时间的DC,Real-time PCR检测miR-200b在DC中的表达。结果表明,随着诱导时间的延长,miR-200b的表达呈递减趋势,提示miR-200b与DC的发育分化相关。第三,依据上述实验结果,进一步利用DOTAP转染试剂将过表达miR-200b和无意义序列NC转染不同发育阶段的DC,即iDC和mDC,通过形态、表型和功能进行相关的鉴定。结果显示,利用DOTAP转染试剂转染小RNA的有效率可达70%以上;进一步对转染miRNA的细胞进行形态学观察,可见转染miR-200b的mDC表面光滑或细胞突起减少,而转染NC和正常DC表面均可见不规则突起;流式细胞术检测细胞表型亦无显著改变, iDC表型为CD14-CD1a+CD83-,而mDC表型为CD14-CD1a+CD83+ ;吞噬实验结果表明,iDC具有很强的吞噬能力,而转染miR-200b的iDC吞噬能力相对较弱,提示miR-200b可能阻碍了iDC的发育;刺激T细胞增殖是mDC的主要功能特征,在MLR体系中,转染NC的mDC和正常mDC对T细胞增殖的刺激能力无显著差异,而转染miR-200b的mDC对T细胞增殖的刺激能力则显著下降;当DC与T细胞的比例为1:10时,mDC、NC-mDC、miR-200b-mDC的cpm值分别为3623±287.7、3366±183.2和2250±136.2; DC与T细胞的比例为1:50时,mDC、NC-mDC、200b-mDC的cpm值分别为934.8±180.6、882±123和546.8±75.84,上述结果表明miR-200b可使iDC的吞噬能力降低,mDC刺激T细胞增殖的能力降低。另外,在MLR反应体系中细胞因子的表达出现显著改变,miR-200b-mDC组作为DC成熟标志的细胞因子IL-12分泌量显著降低,且发挥刺激T细胞增殖的细胞因子IL-2、IL-6也显著降低,而抑制性因子IL-10虽表达量很低,却高于mDC和NC-mDC在MLR体系中的表达水平,提示miR-200b无论是从形态,还是功能上均对DC的发育分化起到抑制作用。上述研究结果提示, miR-200b对DC的发育具有抑制作用,但作用靶点尚不清楚,仍需进一步研究。本研究为进一步系统探讨miR-200b调控DC发育分化的分子机制及临床应用提供了理论与实验依据。

全文目录

英文缩略词  4-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
第一部分外周血单核细胞来源树突状细胞的分离培养与鉴定  16-30
  实验流程  17-18
  材料与方法  18-21
  结果  21-26
  小结  26-27
  讨论  27-30
第二部分 miR-2006对树突状细胞发育影响的生物信息学鉴定  30-44
  技术路线  31-32
  材料和方法  32-35
  结果  35-41
  小结  41-42
  讨论  42-44
第三部分 miR-2006对树突状细胞发育的影响  44-58
  试验流程  44-46
  材料和方法  46-50
  结果  50-55
  小结  55-56
  讨论  56-58
总结  58-60
参考文献  60-64
附录  64-65
个人简历  65-67
致谢  67

miR-200b对外周血单核细胞来源树突状细胞发育的影响

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