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胚胎期造血细胞分化潜能分析与内皮祖细胞动员剂研究

作　者: 陈海旭
导　师: 裴雪涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业:
关键词: CD41 AGM 区卵黄囊造血干细胞间质细胞 Me6 EPCs动员下肢缺血损伤血管新生
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

哺乳动物造血的发生与发育是一个非常复杂的过程，具有严格的时空特异性，在胚胎发育过程中造血位点出现于不同的解剖部位，分别为原始造血和永久造血。原始造血最早是由出现于胚胎第7天（E7.0）的卵黄囊（YS）“血岛”产生原始红细胞，和成年人的红血胞在大小形状、基因表型、细胞激素需求上有差别。但永久造血起源于何处仍存在争议，目前主流认为胚胎初生造血干细胞（HSCs）是多个造血位点共同起源，即卵黄囊和胚体的P-Sp/AGM 区，还有认为尿囊和胎盘也可能是发生部位，随后迁移至胎肝大量扩增。研究表明卵黄囊也可产生永久造血干/祖细胞，但由于微环境和其他可能的原因，卵黄囊来源的造血干/祖细胞自我更新能力弱，分化能力强，数量迅速减少。因此，卵黄囊造血表现为胚胎发育过程中第一波的短暂性造血，并不是随后发生的胎肝和骨髓造血的主要来源。近期的一系列研究表明，在E8.25的卵黄囊造血中可以检测出胚胎发育过程中第一波的一过性造血，随着循环系统的形成，在胚体其他部位也出现造血细胞，E8.5的主动脉旁脏层（P-Sp）也出现一波短暂性造血；真正具有长期重建各系造血功能的HSC出现在E10.0的胚内AGM区，并且进一步定位在其中的背主动脉（dorsal aorta，DA）。随后,在胚胎其他的大血管，如卵黄囊动脉以及脐动脉中也发现有造血前体细胞，而且在上述动脉管壁内可见造血细胞簇。由于血液循环系统的建立，定位胚胎期产生的造血干细胞的发生位点是个非常复杂的过程，在研究中，使用合适的胚胎期造血细胞的标志成为研究的关键点之一。CD41，又称αIIb整合素，是众所周知的巨核细胞和血小板的特异性标志，最近研究发现在小鼠胚胎发育过程中CD41的表达标志着原始造血和永久造血的启动发生，并且胚胎发育过程中CD41在YS“血岛”，AGM区和胎盘中都有阶段性表达。内皮细胞、造血细胞和间质细胞在发育过程中关系密切，目前的研究报道主要集中在CD41+细胞向造血分化潜能的研究，然而，小鼠胚胎时期CD41+细胞除造血之外的多向分化潜能尚未阐明清晰。因此，我们拟通过流式细胞仪分选胚胎11.0天（E11.0）的AGM区，卵黄囊和胚胎循环血（CB）中的CD41+细胞，并研究其向间质细胞分化的潜能，为研究胚胎造血发育调控奠定良好的基础。首先我们在体外半固体培养基中进行CD41⁺细胞造血分化潜能研究，AGM区、YS和CB来源的CD41⁺细胞生成造血各谱系的能力有一定差异；随后主要在体内外研究了CD41⁺细胞向间质细胞分化的潜能：（1）体外建立间质细胞诱导体系，探讨小鼠胚胎发育过程中AGM区、YS和CB来源的CD41⁺细胞向间质细胞分化潜能；（2）建立一个体内评价CD41⁺细胞向间质细胞分化的动物模型，分选GFP转基因小鼠胚胎发育过程中AGM区、YS和CB来源的GFP⁺CD41⁺细胞进行体内移植，通过免疫荧光检测间质细胞分化标志vimentin、α-SMA、epimorphin（EPM）的表达情况来评估其向间质细胞分化能力；（3）根据CD41表达强弱分析和探讨CD41⁺细胞中具有间质细胞分化潜能的细胞亚群。我们体外实验发现，AGM区的CD41⁺细胞形成的贴壁的成纤维样间质细胞增殖能力较强，至少能扩增5-6代；YS来源的CD41^<sup>+细胞也能生成贴壁的成纤维样间质细胞，但其只能扩增1-2代，增殖能力较弱；CB来源的CD41^<sup>+细胞只有很少一部分能生成贴壁的成纤维样间质细胞，大多都是圆形不贴壁的造血细胞。免疫荧光结果表明，无论AGM区还是YS来源的成纤维样间质细胞都表达成纤维母细胞标志vimentin和α-SMA，而CB中只有极少量的甚至无vimentin和α-SMA的表达。体内实验通过建立半致死剂量辐射损伤小鼠模型，移植GFP⁺CD41⁺细胞后，从第二周开始直至第四周，检测受体小鼠外周血中GFP表达情况，发现AGM区来源的GFP⁺CD41⁺细胞造血重建能力远远强于YS和CB来源的GFP⁺CD41⁺细胞，YS来源的GFP⁺CD41⁺细胞呈现短暂性造血重建；检测受体骨髓中GFP⁺CD45⁺嵌合情况，发现AGM区来源的GFP⁺CD41⁺细胞能归巢到受体骨髓进行造血重建，而YS和CB来源的GFP⁺CD41⁺细胞很少归巢至骨髓。与此同时，我们在AGM区和YS来源的GFP⁺CD41⁺细胞移植组小鼠肺部切片中发现有GFP⁺细胞，并沿着血管外周形成管腔样结构，对这些GFP⁺细胞的进一步鉴定表明其表达间质细胞标志vimentin/α-SMA/EPM，并还检测到有少部分细胞表达造血/内皮细胞标志CD31⁺，而在CB来源的GFP⁺CD41⁺细胞移植小鼠肺部并没有发现GFP⁺细胞的分布。为了进一步确定CD41⁺细胞中具有间质分化潜能的细胞亚群，我们根据CD41表达强弱，流式分选出AGM区和YS来源的CD41^int和CD41high亚群进行体外间质细胞诱导分化，研究表明AGM区和YS来源的CD41⁺细胞中具有间质细胞分化潜能的一群细胞主要在CD41^int中。随后又对AGM区和YS来源的CD41^int做了进一步鉴定研究，联合利用CD34标志双色分选出CD41^intCD34-和CD41^intCD34⁺细胞，发现AGM区来源CD41^intCD34-细胞具有间质细胞分化能力，而CD41^intCD34⁺细胞未观察到间质分化潜能；YS来源CD41^intCD34-细胞和CD41^intCD34⁺细胞都具有间质细胞分化潜能。综上所述，我们的研究初步表明：（1）AGM区、YS和CB来源的CD41⁺细胞体外除了能向造血各谱系分化外，在体内外一定条件下，还能向间质细胞分化，且AGM区来源的CD41⁺细胞形成的间质细胞增殖能力远远强于YS和CB来源的CD41⁺细胞。（2）体内移植实验中，只有AGM区和YS来源的CD41⁺具有间质分化能力，且AGM区来源的CD41⁺细胞造血重建能力强于YS和CB来源的CD41⁺细胞。（3）AGM区和YS来源的CD41⁺细胞中具有间质细胞分化潜能的一群细胞主要在CD41^int中。联用CD34标志双标分选出CD41^intCD34-和CD41^intCD34⁺细胞中，AGM区来源的CD41^intCD34^-细胞具有间质细胞分化能力，而CD41^intCD34⁺细胞未观察到；YS来源的CD41^intCD34-细胞和CD41^intCD34⁺细胞都具有间质细胞分化潜能。缺血性疾病是一类严重威胁人类健康和生存质量的疾病，包括心脑血管缺血和严重肢体缺血损伤。目前，临床治疗手段主要包括药物治疗、血管旁路重建、血管腔内成形或支架术等,治疗方法无实质性改进，疗效也不理想。“治疗性血管新生”（therapeutic neovascularization）的提出为缺血性疾病的治疗提出新策略，应用内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）植入术可促进缺血组织的血管新生和侧枝循环形成，增强血流灌注，治疗缺血性疾病。外周血中EPCs是同时表达Sca-1和Flk-1表面标志的一群可向血管内皮分化的高增殖潜能前体细胞，可替代凋亡或坏死的内皮细胞，参与损伤后的血管新生。通过外源性移植EPCs可促进缺血心肌和肢体骨骼肌血管的新生。近年来的研究发现干细胞动员药物对治疗缺血性疾病有一定的疗效，可动员自体骨髓中的干细胞到损伤组织，促进血管新生、恢复缺血组织功能，为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。干细胞动员过程复杂，SDF-1α/CXCR4轴在骨髓干细胞的迁移与归巢中发挥重要的作用。SDF-1α的趋化作用由其受体CXCR4介导。骨髓中HSCs和EPCs高表达CXCR4，基质细胞分泌SDF-1α对此类细胞具有趋化作用。干细胞归巢与动员是个互为镜像的动态过程。通过扰动SDF-1α/CXCR4轴可大量动员骨髓干细胞进入外周血。缺血、缺氧及组织损伤等病理变化均可使缺血损伤组织SDF-1α的分泌显著增强，形成SDF-1α浓度梯度差，骨髓中高表达CXCR4的EPCs能够沿着SDF-1α的浓度梯度迁移至损伤部位参与修复。但正常外周血中EPCs数量很低，这种代偿性的EPCs动员过程不足以用来修复损伤组织，通过干细胞动员药物则能打破这一限制，大量动员骨髓中EPCs并迁移至缺血组织，促进血管新生，恢复缺血组织功能。目前研究发现的细胞因子包括G-CSF，GM-CSF，VEGF和雌二醇（estradiol），CXCR4拮抗剂AMD3100，及一氧化氮（NO）和血管生成素（angiopoietin）均可不同程度动员骨髓干细胞进入外周血。这些干细胞动员剂对内皮祖细胞的动员效果及促进缺血组织恢复的能力还需进一步改进，部分动员剂反复给药会引发副作用。因此，研发新型、高效、无毒副作用的干细胞动员剂成为研究和开发的热点。本研究中，我们首次研究发现了一种饱和胺类小分子化合物Me6可持续大量动员EPCs，促进缺血组织血管的新生，对下肢缺血性疾病的修复具有一定的作用。我们研究证明Me6皮下给药后小鼠的外周血和脾脏中Sca-1+Flk-1+细胞含量均显著增加。Me6在给药12h后的通过流式检测显示外周血中内皮祖细胞Sca-1+Flk-1+比例是正常血中的3倍（Me61.98±0.13%vs. vehicle control0.71±0.09%），统计分析与对照组间存在显著性差异（**p<0.01），直至72h后外周血中Sca-1+Flk-1+比例恢复正常。脾脏具有募集内皮祖细胞的功能，同时在此作用时间点，脾脏中这群Sca-1+Flk-1+细胞（Me67.33±0.71%vs. vehicle control3.3±0.37%）的比例也上调，统计数据与正常对照组的脾脏中内皮祖细胞数量具有统计学意义（**p<0.01）。流式检测外周血还发现Me6还能显著上调CD34的表达（Me619.5±1.4vs. vehicle control14.8±0.76），而间充质干细胞相关标志并没有明显变化，CD29有轻微上调，CD105没有变化。为进一步评估Me6动员的EPCs促进缺血下肢损伤修复的功能，我们建立了小鼠下肢缺血模型，将Me6或PBS处理小鼠的外周血单个核细胞移植到小鼠下肢缺血损伤肌肉组织中，应用激光多普勒（LDPI）指数（由缺血下肢与正常下肢之比值来计算）经行评估血流灌注恢复效果。结果发现移植了Me6给药小鼠的外周血细胞能明显促进缺血下肢血流灌注的恢复。我们进一步观察了Me6对下肢缺血损伤小鼠的EPCs动员效果。建立小鼠下肢缺血模型在第7天给药检测各组外周血中Sca-1+Flk-1+比例（Me63.09±0.5%; AMD31003.17±0.4%; vehicle control1.49±0.1%），发现结果表明Me6能有效动员下肢缺血损伤小鼠骨髓中的EPCs至外周血中。进一步研究结果证明Me6能直接动员自体骨髓中的EPCs进入外周血，进而被募集到缺血损失组织，分化为血管内皮参与血管新生。对下肢缺血损伤小鼠皮下注射Me6后的治疗效果观察中发现，经Me6治疗的小鼠，其缺血损伤的下肢血流灌注得到了很好的恢复，新生血管数量显著高于对照组。结果表明，Me6能大量高效地动员自体骨髓中Sca-1+Flk-1+内皮祖细胞到外周血，并迁移至缺血部位增殖分化，参与新生血管的形成，增强血流灌注，改善下肢远端血运和氧供。通过初步探索小分子Me6的动员EPCs作用机理发现：Me6通过上调骨髓中MMP-9的表达和释放，从而降解骨髓基质上清中SDF-1α的浓度，并从12h一直持续到48h（49.7%±2.6%）与缺血受损部位之间形成SDF-1α浓度梯度差，同时还明显上调骨髓单个核细胞的CXCR4的表达（Me654.9±6.1%vs. vehicle control29.1±4.3%），并能干扰SDF-1/CXCR4信号通路，降低EPCs对骨髓“龛”的附着能力，促使其从骨髓中释放进入外周血，并向缺血受损组织迁移，进而促进血管新生和功能恢复。我们的研究证明，小分子Me6可持续大量安全有效地动员自体EPCs，促进缺血损伤部位血管再生与血流灌注，修复下肢缺血损伤。进一步开发Me6在治疗下肢缺血性疾病方面的成药性等，有望为临床治疗相关疾病提供很好的治疗手段。此外，心脑血管缺血性疾病与肢体缺血的病变机制相类似，这种自体血管再生手段将为其它缺血性疾病的治疗提供有益的参考。

全文目录

英文缩略词  7-10
第一部分 E11.0 小鼠 AGM 和 YS 来源的 CD41~+细胞间质分化潜能的研究  10-52
  中文摘要  10-13
  Abstract  13-15
  前言  15-18
  第一节 CD41~+细胞的体外分化潜能研究  18-32
    实验流程  18
    材料方法  18-24
    结果  24-31
    小结  31-32
  第二节 CD41~+细胞体内间质分化潜能研究  32-42
    实验流程  32-33
    材料方法  33-35
    结果  35-41
    小结  41-42
  第三节 AGM 区和 YS 来源的 CD41~+细胞中具有间质细胞分化潜能亚群的分析  42-49
    材料方法  42-44
    结果  44-48
    小结  48-49
  讨论  49-51
  结论  51-52
第二部分小分子 Me6 动员内皮祖细胞促进下肢缺血损伤修复的研究  52-111
  中文摘要  52-55
  Abstract  55-58
  前言  58-62
  第一节 Me6 动员内皮祖细胞动力学分析  62-73
    实验流程  62
    材料方法  62-66
    结果  66-72
    小结  72-73
  第二节 Me6 动员内皮祖细胞治疗下肢缺血的效果评价  73-94
    实验流程  73-74
    材料方法  74-79
    结果  79-93
    小结  93-94
  第三节 Me6 通过动员内皮祖细胞机制探讨  94-104
    材料方法  94-98
    结果  98-103
    小结  103-104
  讨论  104-110
  结论  110-111
参考文献  111-122
综述  122-140
  参考文献  129-140
已发表文章  140-157
个人简历  157-159
致谢  159-160

胚胎期造血细胞分化潜能分析与内皮祖细胞动员剂研究

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