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细胞重编程与诱导内胚层多能干细胞的获取与鉴定

作　者: 张文成
导　师: 裴雪涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业:
关键词: 胚胎干细胞体细胞重编程终末期肝病诱导多能干细胞诱导内胚层多能干细胞
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝脏是人体重要的器官，主要承担机体代谢、去氧化、糖原储存、白蛋白分泌以及胆汁分泌等功能，在毒物药物代谢中发挥重要作用。由各种原因引发的终末期肝病是危害人类健康的重大疾病[1]，我国作为肝病大国，这种现象尤为严重。目前针对终末期肝病的唯一有效的治疗方式是肝移植，但是供体短缺、移植后免疫抑制剂的长期应用所致的经济负担、生活质量下降和可能的并发症，以及移植手术本身存在的风险都在一定程度上限制了它的应用[2]。随着干细胞技术的发展与成熟，细胞治疗已成为终末期肝病治疗的一个新选择[3]。而安全、充足、临床获取方便的种子细胞来源是需要解决的首要问题。目前已经尝试用于临床治疗的种子细胞包括胎儿或尸体来源的肝细胞和间充质干细胞，但是，这些细胞分别存在来源、伦理、分化效率、功能维持、作用机理或免疫排斥等问题，并非临床应用的理想细胞来源[4]。胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）是具有自我更新和分化全能性的细胞，理论上可以分化形成机体所有类型的细胞，因此在重大疾病细胞治疗、药物筛选、疾病模型建立等方面具有巨大的应用潜能。但是由于来源于胚胎发育囊胚期内细胞团（inner cell mass，ICM），由此而带来的伦理争议大大地阻碍了ESC的应用。此外，ESC在疾病治疗中存在的免疫排斥问题以及形成畸胎瘤的风险同样制约着ESC的应用。诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）是通过体细胞重编程技术从成体细胞获得的类似于ESC的多能性干细胞。iPSC不但具有和ESC一样的分化潜能，而且由于来源于病人自体的体细胞，在克服ESC应用的伦理争议问题的同时，更有利于实现对病人或者疾病的个体化治疗。然而，即使目前众多研究已经通过经典的重编程方法从几乎所有的体细胞获得了iPSC[5][6]，并证实iPSC可向功能性的肝[7]、心肌[8]和血液[9]等功能性细胞诱导分化，但仍旧无法规避其在应用中重编程效率和诱导分化效率较低，以及成瘤性的风险。近年来，越来越多的研究证实通过谱系重编程的方式，可以将终末分化的细胞进行直接转分化，或者去分化成为其祖细胞，通过这种方式不但可以为临床应用提供足够的种子细胞，而且也避免了重编程路径长、诱导分化谱系杂和成瘤性的风险，从而可以为重大性疾病细胞治疗的临床应用寻找更为理想可控的种子细胞。因此，我们针对起始细胞选择、重编程策略优化、小分子化合物引入、重编程目的细胞鉴定等问题进行了系统研究。本论文主要分为两大部分，在第一部分中，我们利用经典的体细胞重编程方式从人包皮成纤维（human foreskin fibroblast,HFF）细胞诱导获得了iPSC，并证实其在体外具有多向分化潜能；在第二部分中，我们通过筛选较为原始、并且与肝脏具有发育相关性的消化道上皮干/祖细胞作为重编程的起始细胞，实现通过非病毒载体的理化方式获得诱导内胚层多能干细胞（inducedendodermal mutipotent stem cell,iEMSC），再将iEMSC定向诱导分化，获得功能性肝细胞，进而为包括终末期肝病在内的重大性疾病的细胞治疗提供理想的种子细胞来源。一、利用多能性相关转录因子将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）自2006年日本京都大学Yamanaka实验室通过向MEF中导入ESC全能性特异的转录因子Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2获得了iPSC开始[6]，目前已经有众多研究通过相似的方法从几乎所有类型的成体终末分化的细胞重编程获得iPSC，并且也可以将iPSC诱导分化获得功能性的成熟细胞。iPSC的出现，不但为终末期肝病等重大疾病的细胞治疗提供了患者和疾病特异性的种子细胞，同样也为干细胞与再生医学的机制研究提供了理想的体外研究模型。所以在本部分研究中，我们利用Yamanaka实验室的诱导重编程体系建立了本实验室的iPSC，通过对其造血和成牙分化能力的检测，证实其具有多向诱导分化潜能。以此建立本实验室体细胞重编程机制和临床转化医学的研究平台。首先我们构建了表达Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2的重组腺病毒载体，并与Yamanaka实验室的逆转录病毒载体分别感染HFF细胞。通过25天的诱导，可以获得呈克隆样生长，AP染色阳性的细胞。将这些细胞在体外进行传代扩增并进行验证，免疫荧光的结果显示这些细胞表达ESC的全能性标志Oct4、Nanog和SSEA-3；通过RT-PCR对内源性和外源性基因的检测结果证实这些细胞内表达内源性的多能性基因，而外源性多能性基因被很好的沉默，初步证实了获得的细胞是iPSC。为了验证iPSC的体外分化能力，我们将获得的iPSC和ESC分别与OP9共培养进行造血诱导分化，并验证Wnt3a在此过程中的作用。通过对各个阶段的标志的流式检测结果显示，在诱导分化第3.75天时，不管是iPSC还是ESC组，与Wnt3a-OP9共培养的实验组Flk-1~+细胞的比例都较OP9共培养组有明显的上升，其中iPSC-Wnt3a-OP9组为59.06%，iPSC-OP9组比例为47.11%；ESC-Wnt3a-OP9中为31.91%，明显高于ESC-OP9的22.88%。在共培养第5天时，同样在miPSC和mESC-EBs两种细胞的共培养体系中，实验组CD41~+细胞的比例较OP9共培养组也都有明显的上升。通过我们的研究，我们首先证实iPSC在体外具有和ESC相同的造血诱导分化能力，同时也证实在ESC和iPSC造血诱导分化早期，Wnt3a可以明显提高两者的造血诱导分化效率。同时，通过将iPSC来源的EBs和分离培养的小鼠牙胚间质细胞共培养并移植于小鼠肾包囊4周后可以观察到牙芽的形成，RT-PCR结果显示牙源性上皮细胞Msx1、Lhx7、Pax9和Runx2的表达，说明iPSC具有向牙源性上皮细胞诱导分化的能力。从而证实了iPSC的多向诱导分化能力，为日后iPSC向功能性肝细胞诱导分化获得患者特异性的种子细胞提供了良好的技术平台。二、利用小分子化合物将上皮细胞谱系重编程获得诱导内胚层多能干细胞（iEMSC）虽然iPSC保留了ESC的优势并避免了ESC应用的伦理争议和免疫排斥问题，但是iPSC在应用中依然存在着重编程路径长、诱导分化谱系杂和成瘤性的风险。此外，大量的外源性基因改造导致的iPSC染色体异常、重编程过程中病毒载体的使用以及低效率等问题都是iPSC在应用前有待解决的问题。近两年，谱系重编程由于具有重编程路径相对短、诱导分化谱系局限性和不具有形成畸胎瘤风险的优势，为解决iPSC应用中存在问题提供了可行的突破方案。并且，通过选择合适的起始细胞，完全可以实现用更少的转录因子或者不需要转录因子和非病毒载体介导的策略实现体细胞重编程。在本部分研究中，我们选择患者来源的消化道上皮干/祖细胞作为起始细胞，通过较为安全的非病毒载体理化方式，将其重编程为分化能力低于ESC和iPSC的iEMSC。通过对iEMSC的鉴定，证实其为类似于定型内胚层（Definitive endoderm，DE）的内胚层多能干细胞。首先，我们对获得的消化道组织进行了组织原位鉴定，发现在胃窦、十二指肠粘膜、结肠隐窝等部位存在着表达CK19、CXCR4、EpCAM、Sox9、Lgr5的上皮干/祖细胞。通过实验室建立的原代上皮细胞分离方法，发现获得的上皮干/祖细胞具有一定分化能力，但是体外的增殖能力非常有限的。根据丁盛等人的研究，我们对谱系重编程的最佳小分子组合进行筛选，并通过最适的小分子组合将消化道上皮干/祖细胞谱系重编程获得iEMSC。对iEMSC进行增殖能力、表型、基因型和核型的鉴定，结果显示iEMSC呈克隆样生长，具有良好的体外增殖能力；与ESC来源的DE具有相似的细胞形态，并且表达DE的特异性标志Sox17、FoxA2；实时定量PCR结果显示iEMSC的基因表达谱与DE相似，而完全不同于重编程前的消化道上皮干/祖细胞；对Sox17的启动子区的DNA甲基化状态进行检测，发现较起始细胞发生了很大程度的去甲基化；体外分化结果显示，获得的iEMSC可以分化成为肝细胞、胰岛细胞、肠道细胞和胆管细胞。并对获得的肝细胞进行体外特异性功能验证，结果显示i-Hep具有正常肝细胞所具有的生物学功能。综上所述，我们的研究表明：由于体细胞重编程中表观记忆的存在，起始细胞状态与重编程策略直接相关。通过选择分化程度低、同源性高的干/祖细胞作为起始细胞，可以实现不依赖外源性转录因子、安全可控的理化方式的体细胞重编程，进而为包括终末期肝病的重大性疾病的治疗提供新的、安全可控的种子细胞来源。

全文目录

缩略词表 (Abbreviations)  6-8
摘要  8-12
Abstract  12-16
第一部分利用多能性相关转录因子将体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）11  16-68
  前言  16-19
  第一节体细胞重编程技术的建立和 iPSC 的鉴定  19-48
    实验一多能性相关转录因子的重组腺病毒载体构建  20-35
    实验二利用重组腺病毒和逆转录病毒载体获得人 iPSC  35-48
  第二节 iPSC 多向分化潜能的研究  48-68
    材料与方法  49-55
    实验结果  55-63
    小结  63-64
    讨论  64-67
    结论  67-68
第二部分利用小分子化合物谱系重编程消化道细胞获得诱导内胚层多能干细胞（iEMSC）  68-113
  前言  68-71
  第一节起始细胞的分离、培养和鉴定  71-83
    材料与方法  72-77
    实验结果  77-82
    小结  82-83
  第二节利用小分子化合物组合诱导消化道上皮干/祖细胞获得 iEMSC  83-90
    材料与方法  84-86
    实验结果  86-89
    小结  89-90
  第三节 iEMSC 的鉴定和性能研究  90-113
    材料与方法  91-98
    实验结果  98-108
    小结  108-109
    讨论  109-112
    结论  112-113
参考文献  113-118
附录  118-120
  主要仪器  118-120
与学位论文相关的该研究领域文献综述（全文）  120-123
  参考文献  122-123
在学期间发表的代表性论著（全文）  123-130
个人简历  130-131
致谢  131-132

细胞重编程与诱导内胚层多能干细胞的获取与鉴定

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