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黑线仓鼠白化突变系白化性状产生机理的研究

作　者: 赵彦斌
导　师: 胡仲明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业:
关键词: 黑线仓鼠白化突变系黑色素白化相关基因转录组测序差异基因
分类号: R-332
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

黑线仓鼠白化突变系（A：CHA）的培育在国内外都属首次，本品系的育成为医学生物学提供了新的动物模型，也是我国为国际实验动物领域增添的一个新型品系，具有较高的学术价值。黑线仓鼠白化突变系（A：CHA）建立后显示出比黑线仓鼠更好的应用前景，在皮肤微循环、辐射防护、体表寄生虫以及流行病学等应用方面，都表现出较黑线仓鼠更多的优越性。目前只知道黑线仓鼠白化突变系的基因遗传属于单一隐性遗传，但并不清楚黑线仓鼠白化性状发生的原因，因此非常有必要揭示黑线仓鼠白化突变群白化性状发生机理，弄清楚该突变种群的遗传背景，进一步完善白化黑线仓鼠突变群的基础生物学数据，为其在生物医学中的推广应用奠定基础。本研究以黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织为研究对象，利用组织学、分子生物学和转录组学等方法，对黑线仓鼠与白化突变系的皮肤组织进行比较研究，综合探讨了黑线仓鼠与其白化突变系皮肤组织组织学与分子水平的差异。主要研究内容包括黑线仓鼠及其白化突变系毛囊中黑色素细胞的组织学分析，皮肤组织黑色素细胞超微结构的比较分析，皮肤组织白化相关基因的克隆与生物信息学分析，白化相关基因的表达量比较分析以及基于Illumina测序技术对黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织进行转录组测序和分析。现将实验研究报告如下:1.黑线仓鼠及其白化突变系毛囊中黑色素细胞的组织学分析本研究采用多巴染色来显示黑色素细胞，结果表明，黑线仓鼠与白化突变系的毛囊组织中均有多巴的阳性着色，多巴阳性着色显示的是成熟的黑色素细胞，说明在黑线仓鼠与白化突变系毛囊组织中都有成熟黑色素细胞分布，但分布数量不同。黑线仓鼠的多巴反应阳性区要明显高于白化突变系。多巴阳性区间接反应酪氨酸酶（TYR）的活性，说明白化突变系TYR表达水平显著低于黑线仓鼠。多巴-甲苯胺蓝复染充分显示多巴阳性黑色素在毛囊组织中的分布，黑线仓鼠与白化突变系毛囊组织中黑色素细胞主要存在于毛囊的毛乳头中。2.黑线仓鼠与白化突变系皮肤黑色素细胞的超微结构分析⑴黑线仓鼠的黑色素含量显著高于白化突变系。可见，皮肤组织中黑色素的缺乏是导致黑线仓鼠白化突变系发生的直接原因。⑵相对于黑线仓鼠，白化突变系皮肤组织的黑色素细胞明显较少,黑色素细胞中黑色素体的发育程度低，大多黑色素体为未有黑色素沉积的黑色素前体（pre-melanosome），黑色素细胞中黑色素体的密度明显较小。可见，成熟黑色素细胞的缺乏以及黑色素体中黑色素沉积的缺乏是黑线仓鼠白化发生的组织学特征。3.黑线仓鼠与白化突变系白化相关基因的克隆与序列分析本实验通过对黑线仓鼠及其白化突变系的白化相关基因TYR、TYRP1、TYRP2、P、MITF、Agouti基因进行克隆与序列分析，明确黑线仓鼠白化突变系白化性状产生是否是由于上述基因发生突变所致，结果首次克隆得到了黑线仓鼠及其白化突变系白化相关基因TYR、TYRP1、TYRP2、P、MITF、Agouti基因完整的编码区序列，但对其基因编码区进行生物信息学分析并未发现突变位点，其白化性状产生的机理与已发现的白化机制不同，还有待进一步的研究。4.黑线仓鼠及其白化突变系白化相关基因表达水平比较分析本研究结果表明TYR、TYRP1、TYRP2、P、MITF、Agouti mRNA表达量在黑线仓鼠中是白化突变系的2.5、5.3、1.12、1.7、1.8、1.7倍,结论提示TYR、TYRP1、P、MITF、Agouti的基因表达量与黑线仓鼠白化突变性状的产生存在一定的相关性，本研究为阐明白化相关基因在色素沉着过程中的调控机制,以及黑线仓鼠白化突变系白化性状产生机理奠定了一定的理论基础。5.基于Illumina测序技术对黑线仓鼠及其白化突变系皮肤组织进行转录组测序和分析本研究以黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织为研究对象，应用Illumina/Solexa高通量测序技术对其转录组进行深度测序，使用短序列组装软件SOAP denovo对其转录组测序结果进行从头组装（De novo），建立转录组数据库，并与蛋白数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG进行序列比对、功能注释及代谢通路分析；在此基础上，进行差异表达基因分析，筛选与色素合成相关的基因，对白化机制进行探究。通过本研究共获得7千多万条高质量配对短序列，通过序列组装共获得52,439条Unigenes。通过对黑线仓鼠与白化突变系皮肤转录组进行差异表达基因分析，共筛选出6788条差异表达基因（︱log2Ratio︱≥1且FDR≤0.001），其中表达上调5476条，表达下调1312条，通过GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，这些差异表达基因主要参与细胞代谢、蛋白质翻译、细胞外基质受体相互作用等生物学进程。共筛选出1212条参与色素沉着的Unigenes，其中发生表达上调的有130条，表达下调的有13条，Unigenes基因分布于258条经典Kegg代谢通路图，而筛选得到的色素合成基因位于两个代谢通路中，分别为酪氨酸Kegg代谢通路图和黑色素合成代谢通路图。这些实验结果为进一步研究黑线仓鼠白化突变系白化机制奠定基础并为研究黑线仓鼠的基因结构及功能奠定基础。

全文目录

缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-17
第一章黑线仓鼠及其白化突变系毛囊中黑色素细胞的组织学分析  17-21
  1. 材料与方法  17-18
  2. 结果  18-19
  3. 讨论  19-20
  4. 小结  20
  参考文献  20-21
第二章黑线仓鼠及其白化突变系皮肤组织中黑色素细胞的超微结构观察分析  21-26
  1. 材料与方法  21-22
  2. 结果  22-24
  3. 讨论  24-25
  4. 小结  25
  参考文献  25-26
第三章黑线仓鼠及其白化突变系白化相关基因的克隆与生物信息学分析  26-44
  1. 材料与方法  26-34
  2. 结果  34-41
  3. 讨论  41-42
  4. 小结  42
  参考文献  42-44
第四章黑线仓鼠及其白化突变系白化相关基因表达水平比较分析  44-55
  1. 材料与方法  44-47
  2. 结果  47-53
  3. 讨论  53-54
  4. 小结  54
  参考文献  54-55
第五章基于 Illumina 测序技术对黑线仓鼠及其白化突变系皮肤组织进行转录组测序和分析  55-73
  1. 材料与方法  55-59
  2. 结果  59-70
  3. 讨论  70-72
  4. 小结  72
  参考文献  72-73
结论  73-75
附录  75-83
文献综述  83-98
  参考文献  93-98
博士期间发表的论文目录  98-99
个人简历  99-100
致谢  100

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