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佛手中活性成分提取分离及其体外活性测试研究

作　者: 李文娟
导　师: 徐溢
学　校: 重庆大学
专　业: 药物化学
关键词: 佛手香豆素多糖提取分离抗肿瘤抗氧化
分类号: R284.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

佛手是芸香科植物香橼的干燥果实，主要含有挥发油、香豆素类、黄酮类、多糖等化学成分，具有抗肿瘤、调节免疫、抗炎、抗氧化等药理作用，作为重庆的一种道地药材具有较高研究价值。当前，对佛手植物的开发利用大多停留在其挥发油成分方面，而对佛手中大量的其他活性成分及其相应的生物活性研究却较少。据此，本文在综述佛手药材相关研究进展的基础上，对佛手的活性化学成分及生物活性进行研究，为深入开发利用佛手资源提供科学依据。本文的主要研究工作及成果包括：1.采用溶剂提取法对佛手进行了系统分离和鉴定。以60%乙醇溶液为溶剂对佛手进行提取后，采用有机溶剂萃取，重点对石油醚、乙酸乙酯萃取层进行系统分离，然后利用柱层析、重结晶、制备薄层色谱等方法进行分离纯化，依照理化性质和与标准核磁图谱的对照，鉴定出了五种单体化合物，即：柠檬油素、滨蒿内酯、伞形花内酯、佛手柑内酯和胡萝卜苷，为后续的抗肿瘤活性成分的筛选及测试提供供试品。2.采用单因素实验与正交优化法对佛手多糖的水提工艺进行优化，确定提取佛手多糖的最佳参数为：提取温度90℃、料液比1:15、提取时间2h、提取次数3次。通过苯酚-硫酸法对佛手粗多糖中的总多糖的含量进行测定，测得佛手中总多糖在粗多糖中含量为61.51%。采用逐级醇沉法对佛手多糖类成分进行初步分离，逐级醇沉得三种粗多糖（FSP-1、FSP-2和FSP-3），得率分别为5.75%、3.57%、4.34%，作为此后的抗氧化活性测试物。此外，采用DEAE纤维素柱层析法对佛手粗多糖FSP-1进行了分离纯化，得到2种纯多糖（BP-1、BP-2），BP-1和BP-2水解后，经TLC分析，发现其单糖成分均为葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖。3.采用体外细胞毒性测试实验，对分离得到的四种香豆素类成分（柠檬油素、滨蒿内酯、伞形花内酯、佛手柑内酯）和佛手粗多糖的体外抗肿瘤作用效果进行了测试。通过96孔板培养-荧光检测分析，测试了上述四种香豆素类成分和佛手多糖的体外抗肿瘤作用，结合倒置显微镜观测了上述分离产物对细胞形态的影响。研究显示，柠檬油素、滨蒿内酯和佛手柑内酯对143B人骨肉瘤细胞的生长有明显的抑制作用，显微镜观测柠檬油素、滨蒿内酯和佛手柑内酯三种活性成分对肿瘤细胞生长情况的影响，也显示出其对肿瘤细胞增殖具有抑制作用。4.基于化学发光分析法建立了适用于佛手多糖体外自由基清除能力测试的抗氧化活性评价方法。该方法根据系统化学发光被抑制的程度，评价佛手多糖对活性氧自由基的体外的清除能力。实验通过优化化学发光体系实验参数，测试得到三种粗多糖（FSP-1、FSP-2和FSP-3）的体外抗氧化活性数据。结果表明上述三种粗多糖对羟基自由基、超氧根离子自由基和过氧化氢具有一定的清除作用，对羟基自由基的清除能力较强，对过氧化氢的清除能力相对较弱，且FSP-3对三种自由基的清除作用均为最大。结果表明，佛手多糖可作为潜在的具有抗氧化活性的天然药物，具有较高的研究价值。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
1 绪论  11-23
  1.1 佛手植物概况  11
  1.2 佛手主要化学成分及其药效  11-13
    1.2.1 香豆素类  11-12
    1.2.2 挥发油类  12
    1.2.3 黄酮类  12
    1.2.4 佛手多糖  12-13
    1.2.5 其他类  13
  1.3 佛手中香豆素化合物研究进展  13-15
    1.3.1 概况  13
    1.3.2 分离纯化方法  13-15
  1.4 佛手多糖的研究进展  15-16
    1.4.1 佛手多糖概况  15
    1.4.2 多糖的提取  15-16
    1.4.3 多糖的分离纯化  16
  1.5 抗肿瘤活性成分体外筛选方法  16-18
  1.6 体外抗氧化活性评价方法  18-21
    1.6.1 清除羟基自由基化学发光反应体系  19-20
    1.6.2 清除超氧阴离子自由基化学发光反应体系  20
    1.6.3 清除过氧化氢化学发光反应体系  20-21
  1.7 研究的目的意义及研究内容  21-23
    1.7.1 研究目的及意义  21
    1.7.2 研究内容  21-22
    1.7.3 技术路线  22-23
2 佛手活性成分的提取分离纯化及鉴定  23-31
  2.1 引言  23
  2.2 仪器与试剂  23-24
    2.2.1 仪器设备  23
    2.2.2 试剂与药品  23-24
  2.3 提取溶剂选择  24-25
  2.4 佛手活性成分提取  25
  2.5 中小极性成分分离  25-28
    2.5.1 石油醚浸膏中组分分离  25-27
    2.5.2 乙酸乙酯浸膏中组分分离  27-28
  2.6 分离产物鉴定  28-30
  2.7 本章小结  30-31
3 佛手总多糖提取分离及含量测定  31-51
  3.1 引言  31
  3.2 仪器与试剂  31-32
    3.2.1 仪器设备  31-32
    3.2.2 试剂药品  32
  3.3 佛手粗多糖中总多糖含量测定  32-35
    3.3.1 粗多糖提取与精制  32
    3.3.2 标准曲线制作  32-34
    3.3.3 总多糖含量测定及多糖得率计算  34
    3.3.4 多糖含量测定方法学验证  34-35
    3.3.5 结果与讨论  35
  3.4 佛手多糖提取工艺优化  35-42
    3.4.1 实验流程  35
    3.4.2 佛手多糖提取的单因素实验  35-36
    3.4.3 佛手多糖提取的正交实验设计  36-37
    3.4.4 多糖得率计算  37
    3.4.5 结果和讨论  37-42
  3.5 粗多糖分级醇沉实验  42-44
    3.5.1 分级醇沉实验方法  42-43
    3.5.2 结果和讨论  43-44
  3.6 粗多糖理化性质测定  44-45
    3.6.1 理化性质测试方法  44-45
    3.6.2 结果和讨论  45
  3.7 粗多糖的分离纯化  45-50
    3.7.1 粗多糖分离纯化流程  45-46
    3.7.2 粗多糖初步分离过程  46
    3.7.3 DEAE 纤维素离子交换柱层析纯化  46-48
    3.7.4 佛手多糖组分的薄层色谱分析  48-49
    3.7.5 结果与讨论  49-50
  3.8 本章小结  50-51
4 佛手多糖的体外抗氧化活性研究  51-63
  4.1 引言  51
  4.2 仪器及试剂  51-52
    4.2.1 仪器设备  51
    4.2.2 试剂药品  51-52
  4.3 实验装置和方法  52-53
    4.3.1 实验装置  52
    4.3.2 实验方法  52-53
  4.4 化学发光法测定佛手粗多糖抗氧化性  53-62
    4.4.1 超氧根阴离子自由基清除能力测试  53-55
    4.4.2 羟基自由基清除能力的测试  55-58
    4.4.3 过氧化氢清除能力测试  58-60
    4.4.4 多糖样本抗氧化测试结果  60-62
  4.5 本章小结  62-63
5 佛手活性成分的体外抗肿瘤活性研究  63-71
  5.1 引言  63
  5.2 仪器与试剂  63-64
    5.2.1 仪器与设备  63
    5.2.2 试剂及溶液配置  63-64
  5.3 抗肿瘤活性测试方法  64-65
    5.3.1 细胞培养  64-65
    5.3.2 佛手分离产物对 143B 细胞的作用  65
    5.3.3 荧光标记测试  65
    5.3.4 抑制率的计算  65
  5.4 结果和讨论  65-69
    5.4.1 佛手分离产物对 143B 骨肉瘤细胞增殖的影响  65-68
    5.4.2 佛手中香豆素类成分对 143B 骨肉瘤细胞形态的影响  68-69
  5.5 本章小结  69-71
6 结论与展望  71-73
  6.1 结论  71-72
  6.2 展望  72-73
致谢  73-75
参考文献  75-81
附录 I  81-83
  A 作者在攻读硕士期间发表的论文  81
  B 作者在科研期间参与的科研项目  81-83
附录 II 核磁图谱  83-86

佛手中活性成分提取分离及其体外活性测试研究

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