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不同海洋生境来源微生物胞外多糖的结构及抗氧化活性研究

作　者: 陈艳丽
导　师: 毛文君
学　校: 中国海洋大学
专　业: 药物化学
关键词: 胞外多糖分离纯化结构表征抗氧化活性海洋微生物
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

海洋微生物所处的独特生存环境,使其具有产生新颖化学结构和独特生物学活性胞外多糖的潜质,是开发海洋多糖类药物的新资源。微生物胞外多糖作为天然活性生物大分子,在生物医药、日用化工等领域日益受到人们的广泛关注。本论文以十六种海洋来源的微生物发酵液为研究对象,提取胞外多糖并对其得率、理化性质和单糖组成进行分析,从中筛选得到五株海洋微生物,分别为珊瑚共生真菌Penicillium commune518#;厚藤共生真菌Fusarium oxysporum Y24-2;苔藓共生真菌Penicillium purpurogenum ZZ05-4;红树林根泥真菌,Trichoderma.sp ghq-198和胶州湾海泥真菌Penicillium.sp ghq-18,对从中提取得到的胞外多糖进行进一步的分离纯化、结构解析和抗氧化活性评价。研究结果如下：1.十六种微生物胞外多糖的提取得率在0.43-3.56g/L之间；总糖含量在55.45%～92.30%之间；蛋白含量在0.82%～13.65%之间；所有胞外多糖中均没有检测到硫酸根的存在。在得到的十六种胞外多糖中,七种胞外多糖的单糖组成以甘露糖和葡萄糖为主,两种以甘露糖和半乳糖为主,三种以相似比例的甘露糖、葡萄糖和半乳糖为主,另外编号为AH17-3和GW3-13的两种微生物产胞外多糖还含有较高比例的葡萄糖醛酸和葡萄糖胺。分析表明,不同来源的微生物产胞外多糖在得率单糖组成和理化性质上均有较大差异。2.从海南直针尖柳珊瑚Muricella abnormalis共生真菌Penicillium commune518#发酵液中提取胞外多糖,经过Q Sepharose Fast Flow阴离子柱层析和Superdex75prep凝胶渗透色谱分离纯化得到三个组分F1P-1S, F1P-2S和F1P-3S,其中主要组分F1P-2S的总糖含量约为96.4%,蛋白含量约为1.23%,分子量为18.6kDa,单糖组成主要由Man、Glc和Gal以27.9%、14.7%和57.4%的比例构成。经过IR,甲基化和NMR分析表明,F1P-2S主要由→6)-p-D-Galf-(1→、→2)-p-D-Galf-(1→、→2,6)-α-D-Manp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→和α-D-Glcp-(1→以大约6:2:1:2比例构成,其中主要以→2)-α-D-Manp-(1→作为主链,在O-6位存在一个以呋喃半乳糖为主的长链分支的葡萄甘露半乳聚糖。体外抗氧化活性分析表明,F1P-2S具有良好的体外清除DPPH自由基活性,ECso为2.87mg/mL。该结构的胞外多糖是首次从珊瑚来源的真菌中分离得到的,对海洋微生物胞外多糖的研究具有重要意义。3.厚藤共生真菌Fusarium oxysporumY24-2胞外多糖经离子交换柱层析分离得到TW和TS两个组分,得率分别为17%和36%；TS进一步经过Sephacryl S-100HR凝胶柱层析纯化得到分子量大约为61.2kDa的纯品胞外多糖TS-1。TS-1的总糖含量在91.3%左右,蛋白含量约为0.79%,主要由Man、Glc和Gal以1.33：1.30：1.00的比例构成。甲基化、IR和NMR分析表明,TS-1主要由→6)-β-D-Galf-(1→为主要连接方式,并在每个呋喃半乳糖的C-2位存在分支,分支部分的结构片段由β-D-Manp-(1→2)-β-D-Manp-(1→2)-α-D-Glep-(1→、α-D-Glcp-(1→和β-D-Manp-(1→2)-α-D-Glcp-(1→以1:2:1的比例构成,该类型的胞外多糖在海洋来源Fusarium oxysporum中十分罕见。体外抗氧化活性分析表明,TS-1具有良好的体外清除DPPH自由基,羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力,特别是体外清除羟基自由基的能力为最好,其ECso值为1.15mg/mL,可以作为一个抗氧化活性胞外多糖的新来源。为海洋共附生植物中结构新颖、活性独特胞外多糖的研究和应用奠定了基础。4.苔藓内生真菌Penicillium purpurogenum ZZ05-4胞外多糖经过阴离子交换柱层析和凝胶渗透色谱分离纯化得到两种分子量分别为28.69kDa和43.91kDa的胞外多糖组分WHW-1和WHS-1。总糖含量和蛋白含量分别为90.30%～87.74%和2.69%-4.35%。甲基化、IR和NMR分析表明,WHW-1是由α-D-Manp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→和→2,6)-α-D-Manp-(1→残基构成的甘露聚糖,主要在→6)-α-D-Manp-(1→的C-2位存在分支结构；WHS-1主要由Man、Glc和Gal以4.20：1.30：0.02的比例构成的中性杂多糖,部分酸水解后GC-MS分析表明,WHS-1主要由→2)-α-D-Manp-(1→构成主链,末端Manp,和→2)-α-D-Manp-(1→构成支链部分,在整个糖环结构的最外围部分连接有→5)-Galf-(1→和末端Ga残基的结构。该类结构的胞外多糖在苔藓来源的Penicillium purpurogenum中鲜见报道。5.红树林根泥真菌Trichoderma.sp ghq-198胞外多糖经过离子交换柱层析分离得到水洗组分HQW和0.6M盐洗组分HQS,得率分别为10.07%和45.42%。Superdex75prep凝胶渗透纯化获得分子量分别为12.87kDa的HQW1和29.82kDa的HQS1。HQS1糖含量和蛋白含量分别为88.84%和3.49%。HQS1则主要由Man: Glc: Gal以5.92：0.87：3.98的比例构成,HQS1经甲基化分析发现连接方式非常复杂,共存在非还原末端的Manp和Galf,→2)-Manp-(1→,→3)-Manp-(1→,→2)-Galp(1→,→6)→Manp-(1→,→6)-Galf-(1→,→5,6)-Galf(1→,→3)-Manp-(1→,→3,6)-Manp-(1→和→2,3,6)-Manp-(1→11种连接方式,部分酸水解后GC-MS分析表明,沉淀部分HQS1→P主要由→2)→Manp-(1→,→6)-Manp-(1→,→3)-Manp-(1→,→2,6)-Manp-(1→及非还原末端Manp构成。其中→6)-Manp-(1→和→2)-Manp-(1→的连接方式明显增加,说明可这两种连接方式构成了多糖的主链结构。对HQS1进行了寡糖降解条件的摸索和制备,获得聚合度为2-4含有取代甲基的寡糖片段。丰富了“海洋糖库”中特征寡糖和多糖的结构。体外氧化活性分析表明HQS1具有一定的体外清除DPPH自由基,羟基自由基和超阳阴离子自由基活性。6.胶州湾海泥真菌Penicillium sp.ghq-18胞外多糖经过阴离子交换柱层析和凝胶柱色谱分离纯化后主要得到四个多糖组分HW-1、HW-2、HS1-1和HS2-1。四者的得率分别为53.21%、9.22%、61.08%和37.59%；经过HPGPC测定其分子量分别为16.9kDa、11.3kDa、20.7kDa和26.6kDa；主要组分HS1-1的单糖组成比例为Man：Glc：Gal=14.76：1.00：6.53,总糖含量为95.45%,还含有2.86%的蛋白质。IR,甲基化和NMR分析表明HS1-1是一个半乳甘露聚糖,甘露糖核心部分由→2)-α-Manp(1→、→6)-α-Manp(1→构成主链,在1,2-连接甘露糖的C-3和C-6位存在α-Manp(1→分支；呋喃半乳糖部分是以p-(1→5)-Ga1f作主链,在O-6位存在非还原末端Galf的取代结构。体外抗氧化活性测试表明HS1-1具有一定的体外清除DPPH,羟基自由基和超氧游离基的活性。该研究表明海洋基质底泥来源真菌是活性胞外多糖的重要来源。本论文的研究成果丰富了“海洋糖库”的数据资源,为海洋糖类药物和功能性食品的研究和开发提供了一定的理论基础,对进一步丰富微生物胞外多糖产品市场具有重要的指导意义。

不同海洋生境来源微生物胞外多糖的结构及抗氧化活性研究

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