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海洋弧菌QY105中褐藻胶裂解酶的研究

作　者: 王亚
导　师: 于文功
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 生物乙醇褐藻胶裂解酶褐藻胶寡糖酶褐藻
分类号: R282.77
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着人类对资源的需求量日益增加，造成地球能源接近枯竭，所以各国政府开始关心重视新能源的开发利用。在新能源中生物能源备受关注，从海藻中获得生物能源以其不占用土地，不争用粮食供给，不需洁净水源，不使用肥料等优点而更为突出。并且在一些国家，褐藻已经进行了大规模的养殖，每年产生褐藻干重1500万公吨，我省仅荣成市年均生产鲜海带可达100余万吨，就为褐藻产生生物能源提供了丰富的原料。褐藻主要有三种组成成分：葡萄糖、甘露醇和褐藻胶，大肠杆菌自身可以利用葡萄糖和甘露醇，却无法利用褐藻胶。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate acid，M）及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronate acid，G）两种糖醛酸单体通过1，4糖苷键聚合而成的一种水溶性酸性多糖。褐藻胶的聚合方式有三种：由多聚β-D-甘露糖醛酸构成均聚物（polyM）；由多聚α-L-古罗糖醛酸构成均聚物（ployG）；由β-D-甘露糖醛酸与α-L-古罗糖醛酸组成的MG随机交替片段（polyMG）。褐藻胶裂解酶能以β消除方式催化降解褐藻胶，在非还原性末端生成带有C4,5双键的4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronic acid结构，该结构在230-240nm下有强烈的吸收峰。褐藻胶裂解酶根据其降解底物专一性的不同可分为三类：专一性裂解polyM片段的裂解酶（EC4.2.2.3），专一性裂解polyG片段的裂解酶（EC4.2.2.11），以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。目前发现的褐藻胶裂解酶多具有polyM底物偏好性，为了更好更彻底的降解利用褐藻，发现具有polyG底物偏好性的褐藻胶裂解酶及研究褐藻胶寡糖酶具有重要意义。本文筛选得到产酶高，且具有polyG底物偏好性的菌株，命名为QY105。通过16S rDNA基因序列比对确定QY105为弧菌属，即Vibrio sp. QY105。QY105发酵周期短，在发酵到15h时，发酵上清中具有polyG底物偏好性的褐藻胶裂解酶酶活几乎达到最高酶活的90%，发酵20h即可达到最高酶活。其发酵上清经过硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析三步分离纯化即可达到电泳纯水平，其分子量为37kDa。AlyV5的得率为7.5%，被浓缩了23.6倍，比活力为2152U/mg。AlyV5最适温度为38℃，在pH7.0的Tris-HCl缓冲体系中酶活最高。AlyV5在60℃保温1h或90℃保温10min后，其剩余酶活可达到原来的40%。AlyV5在pH6.0-9.0的缓冲体系中4℃存放12h后仍保持80%的酶活力。NaCl对酶活有明显的促进作用，没有NaCl的反应体系中几乎测不到酶活；K⁺、Li⁺、NH₄⁺对于酶的活性无明显影响；Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺对酶活有促进作用，Cu²⁺、Fe³⁺对于该酶的活性有明显的抑制作用；其余金属离子对AlyV5的酶活力有不同程度的抑制作用；而1mM的SDS对于酶活的影响不大，EDTA却明显抑制AlyV5的酶活力。在底物特异性研究中，AlyV5对polyG具有偏好性，但同时也可以降解polyM，并且降解polyG的终产物主要为二、三、四糖，而降解polyM最终产物主要为三、四、五糖。因此，AlyV5所能降解的最小寡糖为polyG的五糖单元及polyM的六糖单元。将其与polyM偏好性褐藻胶裂解酶混合使用，测得的酶活比混合后的理论值高出2倍。为了进一步研究褐藻胶的代谢过程，在研究了褐藻胶裂解酶AlyV5的性质后，我们对其内部的褐藻胶寡糖酶进行了克隆，通过简并PCR及SiteFinding-PCR，得到了三个褐藻胶寡糖酶的全基因序列，通过序列比对分析后，我们发现这三种褐藻胶寡糖酶在弧菌中具有高度保守性。这些酶的发现，将加快利用褐藻胶生产生物乙醇的进程，为解决能源危机提供新的思路。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
0 引言  14-31
  0.1 褐藻胶  14-20
    0.1.1 褐藻胶的来源  14
    0.1.2 褐藻胶的结构  14-15
    0.1.3 褐藻胶在微生物中的代谢  15-16
    0.1.4 褐藻胶生物活性及其应用研究进展  16-20
      0.1.4.1 褐藻胶在日用品中的应用  16
      0.1.4.2 褐藻胶在食品工业中的应用  16-18
      0.1.4.3 褐藻胶在医药领域中的应用  18-20
  0.2 褐藻胶寡糖  20-23
    0.2.1 褐藻胶寡糖制备方法  20-21
      0.2.1.1 物理降解法  20
      0.2.1.2 化学降解法  20
      0.2.1.3 酶解法  20-21
    0.2.2 褐藻胶寡糖的生物学功能  21-22
      0.2.2.1 抗肿瘤  21
      0.2.2.2 抗凝血  21
      0.2.2.3 降血糖血脂  21
      0.2.2.4 抗自由基氧化  21
      0.2.2.5 抗炎症  21-22
      0.2.2.6 调节免疫  22
      0.2.2.7 促进生长作用  22
    0.2.3 褐藻胶寡糖的应用  22-23
      0.2.3.1 医药领域  22
      0.2.3.2 食品领域  22-23
      0.2.3.5 农业领域  23
  0.3 褐藻胶裂解酶  23-29
    0.3.1 褐藻胶裂解酶的来源  23-24
    0.3.2 褐藻胶裂解酶的作用机制  24-25
    0.3.3 褐藻胶裂解酶的分类  25-26
    0.3.4 褐藻胶裂解酶的结构  26
    0.3.5 褐藻胶裂解酶的性质  26
    0.3.6 褐藻胶裂解酶的生物学功能  26-27
      0.3.6.1 褐藻胶裂解酶在不产褐藻胶生物中的功能  26-27
      0.3.6.2 褐藻胶裂解酶在产褐藻胶生物中的功能  27
    0.3.7 褐藻胶裂解酶的应用  27-29
      0.3.7.1 褐藻胶寡糖的制备  27
      0.3.7.2 海藻原生质体的制备  27-28
      0.3.7.3 肺囊性纤维化病人的治疗  28
      0.3.7.4 降解海藻废物并再利用  28
      0.3.7.5 生物能源  28
      0.3.7.6 农业生产应用  28-29
    0.3.8 褐藻胶裂解酶的应用前景展望  29
  0.4 本论文的主要研究内容  29-31
1 褐藻胶裂解酶菌株的筛选及鉴定  31-45
  1.1 材料方法  31-37
    1.1.1 实验材料  31-32
      1.1.1.1 实验试剂  31
      1.1.1.2 主要仪器  31
      1.1.1.3 培养基  31-32
    1.1.2 实验方法  32-37
      1.1.2.1 样品采集  32
      1.1.2.2 产酶菌株筛选  32
      1.1.2.3 酶活测定方法及酶活定义  32
      1.1.2.4 菌种保存  32-33
      1.1.2.5 底物偏好性测定  33
      1.1.2.6 细菌基因组 DNA 提取  33
      1.1.2.7 菌株 16S rDNA 基因克隆  33-37
      1.1.2.8 16S rDNA 序列测定及分析  37
  1.2 实验结果  37-43
    1.2.1 样品采集  37-38
    1.2.2 活性菌株的筛选  38-39
    1.2.3 菌株种属鉴定  39-43
      1.2.3.1 菌株基因组的提取  39-40
      1.2.3.2 菌株 16S rDNA 基因克隆  40-41
      1.2.3.3 构建 Vibrio sp. QY105 分支系统树  41-43
  1.3 讨论  43-44
  1.4 小结  44-45
2 褐藻胶裂解酶 AlyV5 的分离纯化  45-53
  2.1 材料方法  45-48
    2.1.1 实验材料  45-46
      2.1.1.1 实验试剂  45
      2.1.1.2 主要仪器  45
      2.1.1.3 培养基  45-46
    2.1.2 实验方法  46-48
  2.2 实验结果  48-52
    2.2.1 产酶曲线的测定  48-49
    2.2.2 蛋白含量测定  49-50
    2.2.3 硫酸铵沉淀  50
    2.2.4 疏水层析  50
    2.2.5 离子交换层析  50-51
    2.2.6 SDS - PAGE  51
    2.2.7 AlyV5 的分离纯化结果  51-52
  2.3 讨论  52
  2.4 小结  52-53
3 褐藻胶裂解酶 AlyV5 酶学性质  53-63
  3.1 材料方法  53-55
    3.1.1 实验材料  53
      3.1.1.1 实验试剂  53
      3.1.1.2 主要仪器  53
    3.1.2 实验方法  53-55
      3.1.2.1 AlyV5 最适温度测定  53-54
      3.1.2.2 AlyV5 温度稳定性测定  54
      3.1.2.3 AlyV5 最适 pH 测定  54
      3.1.2.4 AlyV5 的 pH 稳定性  54
      3.1.2.5 NaCl 对 AlyV5 酶活影响  54
      3.1.2.6 不同金属离子及 SDS、EDTA 对 AlyV5 酶活的影响  54
      3.1.2.7 AlyV5 底物偏好性的测定  54-55
      3.1.2.8 AlyV5 对底物的最终降解产物分析  55
      3.1.2.9 AlyV5 与不同底物偏好性褐藻胶裂解酶混合使用  55
  3.2 实验结果  55-61
    3.2.1 AlyV5 最适反应温度  55-56
    3.2.2 AlyV5 温度稳定性  56-57
    3.2.3 AlyV5 最适反应 pH  57
    3.2.4 AlyV5 的 pH 稳定性  57
    3.2.5 NaCl 对 AlyV5 酶活的影响  57-59
    3.2.6 不同金属离子及 SDS、EDTA 对 AlyV5 酶活的影响  59
    3.2.7 AlyV5 底物偏好性测定  59-60
    3.2.8 AlyV5 对底物的最终降解产物分析  60-61
    3.2.9 AlyV5 与不同底物偏好性褐藻胶裂解酶混合使用  61
  3.3 讨论  61-62
  3.4 小结  62-63
4 Vibrio sp. QY105 中褐藻胶寡糖酶基因克隆及序列分析  63-86
  4.1 材料与方法  63-67
    4.1.1 实验材料  63-64
      4.1.1.1 实验试剂  63
      4.1.1.2 主要仪器  63-64
      4.1.1.3 培养基  64
    4.1.2 实验方法  64-67
      4.1.2.1 简并 PCR 筛选褐藻胶寡糖酶基因序列  64-65
      4.1.2.2 SiteFinding-PCR 扩增已知序列的两端序列  65-67
  4.2 实验结果  67-84
    4.2.1 简并 PCR 引物  67-68
    4.2.2 梯度 PCR 筛选褐藻胶寡糖酶基因结果  68-70
      4.2.2.1 褐藻胶寡糖酶基因 A（Oal A）  68-69
      4.2.2.3 褐藻胶寡糖酶基因 C（Oal C）  69-70
    4.2.3 测得的序列及序列分析  70-72
      4.2.3.1 褐藻胶寡糖酶基因 A（Oal A）部分序列  70
      4.2.3.2 褐藻胶寡糖酶基因 B（Oal B）部分序列  70-71
      4.2.3.3 褐藻胶寡糖酶基因 C（Oal C）部分序列  71-72
    4.2.4 扩增已知序列两端的序列  72-84
      4.2.4.1 引物设计  73
      4.2.4.2 SiteFinding-PCR  73-78
      4.2.4.3 褐藻胶寡糖酶基因序列及分析  78-84
  4.3 讨论  84-85
  4.4 小结  85-86
5 总结与展望  86-88
  5.1 总结  86-87
  5.2 展望  87-88
参考文献  88-93
致谢  93-94
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  94-95

海洋弧菌QY105中褐藻胶裂解酶的研究

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