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基于代谢组学技术的2型糖尿病中医证的动态研究

作　者: 陈威妮
导　师: 刘志龙
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 2型糖尿病糖尿病前期证候代谢组学气相色谱-质谱联用
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：通过对糖尿病前期(无症状、气阴两虚证)和2型糖尿病(无症状、气阴两虚证)患者血清进行代谢组学检测,分析疾病状态下内源性代谢产物差异,探讨糖尿病前期和2型糖尿病无症状和气阴两虚证的生物学本质,并分析差异性代谢产物可能涉及的代谢通路和信号通路,为2型糖尿病中医证候分类研究提供客观的生物学基础。方法：纳入糖尿病前期辨证为气阴两虚证患者7例,无症状患者28例,2型糖尿病气阴两虚患者6例,无症状者29例,将糖尿病前期、2型糖尿病和健康对照组各35例,采用气相色谱-质谱联用方法(gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)进行代谢组学检测,应用主成分分析法(principal components analysis, PCA)和偏最小二乘判别分析法(partial least squares-discrimination analysis, PLS-DA)进行分析,寻找糖尿病前期、2型糖尿病与健康对照组之间,气阴两虚证与无症状组之间差异性代谢产物,得到特定疾病和中医证候状态下内源性代谢标记物。采用IPA(ingenuity pathway analysis, IPA)分析软件,对差异性代谢产物进行生物信息学分析,根据代谢产物之间相互关系,建立可视化潜在关联网络,寻找差异性代谢产物涉及的经典代谢通路和信号通路,获得可能影响糖尿病前期和2型糖尿病发生发展过程的重要代谢通路和信号通路。结果：1.三组之间性别、尿酸、血脂无显著差异,而年龄、体重、体重指数、腰围、糖化血红蛋白、空腹血糖、OGTT2h血糖,三组存在显著差异。2.PCA图能将2型糖尿病与健康组明显区分开来,虽然糖尿病前期与健康对照组难以区分,但三组之间均存在显著差异性代谢产物。从三组空腹差异性代谢产物结果可得出：(1)糖尿病前期的潜在标记物为：上调代谢产物有：2-羟基丁酸、尿素、葡萄糖、棕榈酸、半乳糖、硬脂酸,下调代谢产物有甘氨酸。(2)2型糖尿病的潜在标记物为：上调代谢产物有：2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、尿素、丙三醇、苯丙氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、酪氨酸、棕榈酸、半乳糖、unknown(rt39.7)、亚油酸、油酸、硬脂酸,下调代谢产物有甘氨酸、赤藓糖。(3)糖尿病前期发展为糖尿病过程中,上调的代谢产物有：2-羟基丁酸、尿素、丙三醇、鸟氨酸、葡萄糖、棕榈酸、半乳糖、亚油酸、油酸、硬脂酸,下调的代谢产物有：赤藓糖。(4)糖尿病前期和2型糖尿病疾病的发生,共同变化的代谢产物有：2-羟基丁酸、尿素、葡萄糖、棕榈酸、半乳糖、硬脂酸均上调,甘氨酸均下调。OGTT2h后差异性代谢产物也有与空腹状态类似规律,糖负荷后,2型糖尿病患者和糖尿病前期患者存在更多种类的脂肪酸类和氨基酸类代谢异常。3.代谢组学分析方法能将三组OGTT2h与空腹明显区分,三组OGTT2h分别与空腹比较均存在差异性代谢产物。健康组OGTT2h与空腹比较,上调的代谢产物主要为葡萄糖、半乳糖,下调的代谢产物以游离脂肪酸、胆固醇、氨基酸、有机酸为主。4.2型糖尿病无症状组和气阴两虚证患者比较,其内源性代谢产物类似,未见明显差别,糖尿病前期无症状组和气阴两虚证患者之间代谢产物亦未见明显差别,说明糖尿病前期和2型糖尿病患者,无症状组和气阴两虚证患者存在相似的病理改变,其内源性代谢产物均产生了一致的变化。5.用IPA软件对差异性代谢产物进行生物信息学分析,糖尿病前期和2型糖尿病均可能涉及的经典代谢通路有：硒氨酸代谢,氨基酸的尿素循环和代谢,谷胱甘肽代谢,氨基酰-tRNA生物合成,赖氨酸分解,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,磷酸戊糖途径,半乳糖代谢,丙酸代谢,糖酵解和糖异生,嘌呤代谢,淀粉和蔗糖代谢,嘧啶代谢,甲烷代谢,氮代谢,胆酸生物合成,脂肪酸生物合成,脂肪酸在线粒体中的延伸,脂肪酸代谢。2型糖尿病可能涉及的代谢通路有：酪氨酸代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,丁酸代谢,甘油酯代谢,酮体的合成和分解,亚油酸代谢。糖尿病前期可能涉及的代谢通路有：类固醇的生物合成,C-21类固醇激素代谢。糖尿病前期与2型糖尿病代谢产物涉及的可能信号通路有：生长激素信号通路,2型糖尿病信号通路,MODY信号通路,巨噬细胞IL-12信号和产生,线粒体功能障碍,胰岛素受体信号,FXR/RXR活化,谷氨酸受体通路,多巴胺-DARPP32在cAMP中的反馈信号。2型糖尿病代谢产物涉及的可能信号通路有：蛋白激酶A信号,多巴胺受体信号。糖尿病前期代谢产物涉及的可能信号通路有：基底细胞癌信号通路,脂／脂筏在流感发病机制中的作用,胞膜窖介导的内吞信号通路,病毒通过内吞入侵通路,LXR/RXR活化。结论：1.GC/MS检测分析能找到糖尿病前期气阴两虚证及无症状患者与健康对照组之间存在内源性代谢产物差异,PCA图有分糖尿病前期组和健康对照组的趋势,糖尿病前期组与健康对照组比较,上调的代谢产物有6个：2-羟基丁酸、尿素、葡萄糖、棕榈酸、半乳糖、硬脂酸；下调的代谢产物1个：甘氨酸。2.GC/MS检测分析能找到2型糖尿病气阴两虚证及无症状患者与健康对照组之间存在内源性代谢产物差异,PCA图可有效区分2型糖尿病组与健康对照组,2型糖尿病组与健康对照组比较,上调的代谢产物有14个：2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、尿素、丙三醇、苯丙氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、酪氨酸、棕榈酸、半乳糖、unknown (rt39.7)、亚油酸、油酸、硬脂酸；下调的代谢产物有2个：甘氨酸、赤藓糖。3.GC/MS的代谢组学检测方法,难以将糖尿病前期气阴两虚证患者与无症状患者、2型糖尿病气阴两虚证患者与无症状组患者区分开来,气阴两虚证与无症状患者之间无明显差异代谢产物,提示这两个亚型之间存在相似的病理变化,中医辨治无症状的糖尿病前期和2型糖尿病患者,可从益气养阴入手,为指导临床合理治疗提供理论依据。4.用IPA软件对差异性代谢产物进行生物信息学分析,涉及的代谢通路和信号通路可能是2型糖尿病和糖尿病前期病理生理过程中重要通路,值得进一步研究。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-9
目录  9-11
引言  11-13
第一章 2型糖尿病中医证候研究现状  13-18
  1.1 2型糖尿病辨证分型研究  13-14
  1.2 2型糖尿病证候分类的临床实验室指标研究  14-15
  1.3 2型糖尿病证候分类的动物实验研究  15-16
  1.4 2型糖尿病证候的系统生物学研究  16-17
    1.4.1 基因组学研究  16
    1.4.2 代谢组学研究  16-17
  1.5 展望  17-18
第二章代谢组学研究及其在中医药中的应用现状  18-25
  2.1 代谢组学相关概念  18-19
  2.2 代谢组学与其他组学的关系  19
  2.3 代谢物分析、鉴定技术  19-20
    2.3.1 基于MS的代谢组学研究  19-20
    2.3.2 基于NMR的代谢组学研究  20
  2.4 代谢组学数据分析与结果解释  20
  2.5 代谢组学在中医药领域中的应用  20-24
    2.5.1 代谢组学在中医临床证候分型的应用  20-21
    2.5.2 代谢组学在动物证候模型中的应用  21-22
    2.5.3 代谢组学在中药研究中的应用  22-24
  2.6 展望  24-25
第三章临床研究  25-30
  3.1 研究对象  25-26
    3.1.1 样本来源  25
    3.1.2 诊断标准  25-26
    3.1.3 纳入标准  26
    3.1.4 排除标准  26
    3.1.5 健康对照组的选择  26
  3.2 研究方法  26-28
    3.2.1 症状体征、实验室检查信息采集  26-27
    3.2.2 血液标本采集  27
    3.2.3 血清代谢组学检测和分析  27-28
  3.3 数据分析  28-30
    3.3.1 统计分析  28
    3.3.2 差异代谢产物生物信息学分析  28-30
第四章结果  30-67
  4.1 一般情况比较  30
  4.2 糖尿病前期组、2型糖尿病组中医辨证结果分析  30
  4.3 糖尿病前期组、2型糖尿病组、健康对照组代谢组学分析  30-39
    4.3.1 总离子流图  30-31
    4.3.2 代谢组学模式识别  31-39
  4.4 糖尿病前期组、糖尿病组、健康对照组差异性代谢物生物信息学分析  39-67
    4.4.1 三组两两比较空腹差异性代谢物代谢通路及信号通路分析  39-46
    4.4.2 三组两两比较OGTT 2h差异性代谢物代谢通路及信号通路分析  46-53
    4.4.3 三组之间比较空腹差异性代谢物代谢通路及信号通路分析  53-58
    4.4.4 三组之间比较OGTT 2h差异性代谢物代谢通路及信号通路分析  58-62
    4.4.5 三组OGTT 2h与空腹比较差异性代谢物代谢通路及信号通路分析  62-67
第五章讨论  67-73
  5.1 代谢组学分析方法是中医证候研究的工具  67
  5.2 以2型糖尿病为切入点探索中医证候动态演变具有良好的基础与可行性.  67
  5.3 2型糖尿病和糖尿病前期与健康组比较差异性代谢产物作用分析  67-70
  5.4 2型糖尿病气阴两虚证和无症状组代谢产物分析  70
  5.5 差异性代谢产物涉及代谢通路和信号通路分析  70-73
    5.5.1 差异性代谢产物涉及代谢通路分析  70-71
    5.5.2 差异性代谢产物涉及信号通路分析  71-73
第六章结论  73-74
参考文献  74-80
在校期间发表论文  80-81
致谢  81

基于代谢组学技术的2型糖尿病中医证的动态研究

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