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基于纳米技术的多级放大压电免疫传感器检测食品中大肠杆菌O157：H7

作　者: 谌志强
导　师: 晁福寰; 李君文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 大肠杆菌O157︰H7 压电免疫传感器信标免疫磁颗粒胶体金金生长
分类号: R155.5
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目前,食品安全问题已被我国列为当今继人口、资源、环境之后的第四大社会问题。而在众多的食品安全问题中,由致病菌或条件致病菌污染食品而造成的食品安全问题事件则是主要原因之一。这些致病菌主要为出血性大肠杆菌O157︰H7（Escherichia coli O157︰H7）、沙门氏菌、副溶血弧菌和变形杆菌等,其中由大肠杆菌O157︰H7引起的食物中毒尤其值得人们关注。大肠杆菌O157︰H7可引起腹泻、出血性肠炎等疾病。大肠杆菌O157︰H7自1982年在美国首次引起食物中毒的爆发,此后世界上许多国家均相继发生大肠杆菌O157︰H7的感染流行。目前,针对大肠杆菌O157︰H7的检测方法众多,但是这些方法大多存在操作繁琐、耗时较长和灵敏度偏低等问题。而大肠杆菌O157︰H7流行病学资料显示其感染剂量很低,不足100个细菌就可引起人类的感染,因此高敏感度的检测方法对大肠杆菌O157︰H7的检测显得尤其重要。压电传感器作为一种新型的生物传感器,其检测理论基础是固载在晶体表面的沉积物质量与晶体频率变化存在着一定的比例关系,根据此比例确定待检测物的量。压电传感器在致病菌检测方面已得到了广泛的应用,但是其灵敏度一般为104～106 CFU/mL,即使在磁颗粒和胶体金颗粒等的“质量放大效应”的帮助下,灵敏度也未低于102CFU/mL,不能满足某些高致病力细菌检测的需要。本研究针对大肠杆菌O157︰H7感染剂量低和压电传感器灵敏度有待提高的问题,利用压电传感器检测时的质量放大原理,并结合信标免疫磁颗粒的分离浓缩技术、功能化胶体金和金生长放大技术等,建立一套可对压电免疫传感器的检测频率信号进行多级放大,从而最大限度提高大肠杆菌O157︰H7检测灵敏度的方法。1.信标免疫磁颗粒的制备:采用化学共沉淀法,利用FeCl₃,FeCl₂和葡聚糖（T-40）在氨水的作用下制备纳米磁颗粒,透射电镜下显示,其粒径较均一,核心粒径约为5 nm。采用凝胶过滤法和超强磁分离法对制备的纳米磁颗粒进行纯化,对2种纯化方法进行比较,最后选择具有操作简便、快速和价格低廉等优点的超强磁法进行纳米磁颗粒纯化。将经过亲和层析法纯化后的大肠杆菌O157︰H7兔多克隆抗体（目标抗体,T-Ab）和生物素化兔IgG（信标抗体,B-Ab）浓度调至0.5 mg/mL,然后将2种抗体分别连接至纳米磁颗粒上制成信标免疫磁颗粒,此过程中目标抗体与信标抗体的系列比例为1︰0,1︰5,1︰10,1︰20,1︰40,1︰60,1︰80和1︰100。综合考虑信标免疫磁颗粒的分离浓缩和连接胶体金的功能,最后确定信标免疫磁颗粒上目标抗体与信标抗体的最适比为1︰60。通过进一步测定信标免疫磁颗粒在不同浓度的大肠杆菌O157︰H7菌液中的回收率,可知其适用范围为浓度低于106 CFU/mL大肠杆菌O157︰H7的菌液,最适加入量为20μL。对信标免疫磁颗粒的回收率进行定时监测可知,它在4℃冰箱中至少可以保存12个月。2.功能化胶体金和金生长液的制备:采用柠檬酸还原法制备粒径约为18 nm的胶体金颗粒,在分光光度计的400 nm-800 nm范围进行扫描,曲线峰值所对应的波长为518.0 nm,并且主峰的间距较窄。通过波长扫描法确定了亲和素连接至胶体金上的最适量16μg/mL。利用免疫渗滤实验验证了制备的金标亲和素可用于后期的压电免疫传感器检测。采用溴化十六烷基三甲铵（cetyltrimethylammonium bromide ,CTAB）法制备金生长液,并确定了其最适加热温度和时间为100℃下10 min,金生长液与胶体金溶液反应的体积比为9︰1。利用透镜电镜观察胶体金颗粒在金生长液在生长放大前后的形态变化,生长放大后的胶体金颗粒直径约为40 nm。3.压电免疫传感器检测大肠杆菌O157︰H7:本实验将石英晶振置于气相中进行频率的测定,当石英晶振的频率变化稳定在±1 Hz时,记录下频率值。采用金黄色葡萄球菌蛋白A （SPA）法进行抗体的固定,确定了SPA在石英晶振上的最佳固定浓度和时间分别是1.2 mg/mL和40 min。大肠杆菌O157︰H7鼠单克隆抗体采用“消减免疫”制备,其特异性达到98%,将抗体通过SPA连接至石英晶振,其最佳固定浓度和时间分别是1.0 mg/mL和60 min。利用信标免疫磁颗粒对大肠杆菌O157︰H7进行分离浓缩后,利用微滤离心管将未结合细菌的信标免疫磁颗粒去除;通过生物素-亲和素系统将金标亲和素连接至信标免疫磁颗粒上,利用超强磁将多余的胶体金去除;利用现配的金生长液对信标免疫磁颗粒上的胶体金颗粒进行生长放大,借助超强磁将多余的金生长液去除;最后将含有大肠杆菌O157︰H7、信标免疫磁颗粒和生长放大的胶体金颗粒的混合物滴加至连接有大肠杆菌O157︰H7单克隆抗体的石英晶振上,利用压电传感器进行频率的检测,检测灵敏度达到23 CFU/mL。将该方法用于检测39份实际食品样品,检测结果与国标方法一致均未检出大肠杆菌O157︰H7,而在样品的加标实验中,其灵敏度为53 CFU/mL,同时出现了3份假阴性结果。本研究借助纳米技术、抗原抗体反应、生物素-亲和素反应及金生长放大技术,制备出了一种全新的信标免疫磁颗粒,该颗粒除了具有传统分离功能外,还增加了连接和质量放大2项功能。将信标免疫磁颗粒与压电免疫传感器结合起来用于检测大肠杆菌O157︰H7,使得压电免疫传感器的检测信号得到了3级放大,最终实现了对大肠杆菌O157︰H7的高灵敏检测,整个检测时间只需4 h。本研究建立了一套检测食品中大肠杆菌O157︰H7的快速、准确和高灵敏的检测方法,对提高我国食品安全保障水平、预防食物中毒的发生将具有十分重要的意义。

全文目录

缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
第一章前言  14-25
  1 引言  14
  2 大肠杆菌0157：H7  14-21
    2.1 概况  14
    2.2 生物学特性  14-15
    2.3 流行病学特点  15-16
    2.4 国内外检测方法研究进展  16-21
      2.4.1 传统的检测方法  17-18
      2.4.2 免疫学检测方法  18-19
      2.4.3 分子生物学检测方法  19-21
  3 压电传感器  21-22
  4 课题研究思路  22-25
第二章信标免疫磁颗粒的制备  25-50
  1 实验材料  25-27
    1.1 主要试剂  25-26
    1.2 仪器和耗材  26-27
    1.3 实验菌株和实验动物  27
  2 方法  27-38
    2.1 大肠杆菌0157︰H7 多克隆抗体的制备  27-33
    2.2 纳米磁颗粒的制备  33-35
    2.3 信标免疫磁颗粒的制备  35-38
  3 结果  38-47
    3.1 大肠杆菌0157︰H7 多克隆抗体  38-41
    3.2 信标免疫磁颗粒  41-47
  4 讨论  47-49
    4.1 纳米免疫磁颗粒的制备  47
    4.2 信标免疫磁颗粒的制备  47-49
  5 小结  49-50
第三章功能化胶体金和金生长液的制备  50-65
  1 实验材料  50-51
    1.1 主要试剂  50-51
    1.2 仪器和耗材  51
  2 方法  51-55
    2.1 胶体金的制备  51-52
    2.2 金标亲和素的制备  52-53
    2.3 金生长液的制备  53-54
    2.4 胶体金和金生长液的联合应用  54-55
  3 结果  55-61
    3.1 胶体金表征  55-56
    3.2 金标亲和素  56-57
    3.3 金生长液的制备与表征  57-60
    3.4 胶体金和金生长液的联合应用  60-61
  4 讨论  61-63
    4.1 胶体金制备  61-62
    4.2 胶体金的标记  62-63
    4.3 金生长液  63
  5 小结  63-65
第四章压电免疫传感器检测大肠杆菌0157︰H7  65-84
  1. 实验材料  65-67
    1.1 主要试剂  65-66
    1.2 仪器和耗材  66
    1.3 实验菌株和实验动物  66-67
  2 方法  67-73
    2.1 大肠杆菌0157︰H7 单克隆抗体的制备  67-69
    2.2 SPA的最佳固定浓度和时间  69
    2.3 大肠杆菌0157︰H7 单克隆抗体的最佳固定浓度和时间  69-70
    2.4 压电免疫传感器检测大肠杆菌0157︰H7 纯菌液  70-71
    2.5 压电免疫传感器检测食品中的大肠杆菌0157︰H7  71-73
    2.6 压电免疫传感器石英晶振的保存期和再生  73
  3 结果  73-80
    3.1 大肠杆菌0157︰H7 单克隆抗体特性  73
    3.2 SPA最佳固定浓度和时间  73-76
    3.3 大肠杆菌0157︰H7 单克隆抗体最佳固定浓度和时间  76-77
    3.4 压电免疫传感器检测大肠杆菌0157︰H7 纯菌液  77-79
    3.5 压电免疫传感器检测实际食品样品  79
    3.6 压电免疫传感器石英晶振的保存期和再生  79-80
  4 讨论  80-82
    4.1 大肠杆菌0157︰H7 单克隆抗体特性  80
    4.2 压电免疫传感器抗体的固定  80-81
    4.3 压电免疫传感器检测大肠杆菌0157︰H7  81-82
  5 小结  82-84
结论与展望  84-85
参考文献  85-95
菌种附录  95-98
发表综述  98-104
  参考文献  101-104
发表论文  104-116
个人简历  116-117
致谢  117

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