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诺如病毒荧光定量检测方法的建立及氯灭活诺如病毒消毒规律研究

作　者: 夏体娇
导　师: 李君文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生学与环境卫生学
关键词: 诺如病毒基因Ⅱ型普通RT-PCR 荧光定量RT-PCR 氯消毒
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究目的：诺如病毒（Norovirus，NoV）是一种引起世界范围内非细菌性急性胃肠炎的主要病毒，是杯状病毒家族的主要成员，能够引起急性腹泻、呕吐的发生，重者可因脱水死亡或自身免疫缺陷导致严重的并发症危及生命。从二十世纪九十年代至今，NoV GII.4已经逐渐成为了世界范围内的优势流行株，并且造成了至少四次全球性的疾病流行。NoV主要通过粪口途径传播，食用被病毒污染的食物、人与人的接触、食用牡蛎、饮水都可以传播该病毒，其次通过呼吸道吸入飞扬的呕吐物微粒也可能是一种传播途径。诺如病毒在环境中高度稳定，但是对人却极易感染，因此也是污染饮用水导致腹泻疾病流行的重要病因。上个世纪七十年代，通过电镜发现了NoV，目前，由于缺乏组织细胞培养系统，对于NoV的消毒机理的研究通常采用替代病毒来进行，例如：鼠NoV（murine norovirus，MNV）、猫杯状病毒（feline calicivirus，FeCV)和犬杯状病毒（canine calicivirus，CaCV)。因此，调查研究我国NoV的流行现况，建立快速、准确的检测方法，为制定相应的控制策略和措施提供依据；对该病毒进行消毒研究，可以更好地提供污水消毒指导方案，进一步保证在污水净化过程中的细菌学和病毒学安全指标的达成。因此，本课题通过RT-PCR方法研究2009年10~11月天津市儿童医院的腹泻婴幼儿NoV的流行情况，建立和评价NoV基因II型的荧光定量RT-qPCR检测方法，采用氯对水中NoV的消毒进行初步研究，为污水中NoV的污染检测、消毒控制和突发公共卫生事件的快速检测提供参考方法和依据。研究方法：收集天津市2009年10~11月儿童医院门诊部和住院部急性腹泻患儿粪便标本319例，其中男198例、女121例，最小年龄为出生后两天，最大为9岁。通过RT-PCR方法确定NoV核酸阳性的标本，将PCR扩增样本交由公司纯化测序，样本序列结果经过编辑与Genbank中公布的基因进行Blast序列比较，从而判断样本的基因型。根据文献报道，从Genbank下载NoV各型参考株序列。应用Bioedit软件进行核苷酸多序列分析比对，利用MEGA4.1软件邻位相连法绘制系统发生树。采用统计学方法分析样本的人口学资料和临床资料。采用RT-PCR检测NoV GII强阳性的样本，PCR产物纯化后克隆转化，蓝白斑阳性克隆筛选，构建质粒，并转录合成copy RNA(cRNA)作为标准品，建立和优化了NoV基因II型荧光定量RT-qPCR方法和反应体系，制作标准曲线，评价该反应体系的灵敏度、特异性、重复性，并进行临床粪便样本的检测评价。以NoV为研究对象，采用不同浓度的氯（1mg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、10mg/L）消毒剂处理水中的NoV，使用三对引物对NoV的灭活情况进行评价，其中自行设计分别针对NoV的5’端、3’端的引物，以及ORF1-ORF2结合区的引物参照文献（见第一章）。PH7.2，室温下，不同时间点取样，通过RT-PCR探索氯对NoV基因损伤位点，采用荧光定量PCR方法进一步检测氯消毒过程中NoV的核酸减少量。初步研究氯对NoV的灭活情况。研究结果：一、2009年10~11月天津市儿童医院腹泻患儿粪便标本中NoV的检出情况经过RT-PCR检测的319例标本中，共检出60例NoV阳性。RT-PCR检测表明，有59例为NoV GII型，有1例为NoV GI型，构成比分别为98.3%和1.7%。24例NoV阳性标本PCR产物纯化和测序，测序结果利用bioedit编辑后提交Genbank进行BLAST比对发现，1例是NoV GI型，其余的23例均为NoVGII型。多序列同源性比对发现，测序毒株17株与荷兰的Nijmegen115参考株、Lincoln House参考株、Beijing151株和Terneuzen70株序列同源性为71.7～99.3%，与Lincoln House参考株同源性高达98.0～99.3%。15例GII-4型中13例是2006b变异株；2例是GII-3型。系统发生树分析显示，2009年天津市腹泻患儿NoV以NoV GII/2006b毒株为主要的流行株，这与我国其他地方目前的研究相似，这表明，目前我国的流行优势株仍然是NoV GII/2006b毒株。不同年龄组NoV阳性的病例分布情况分析表明，60例感染患儿中，0～1岁年龄组的患儿感染NoV35例，1～2岁患儿感染NoV16例，随着年龄的增大，腹泻患儿减少，感染NoV的儿童也较少。婴幼儿NoV的感染主要是集中于0～2岁人群。本研究中门诊腹泻患儿NoV的阳性率是26.75%（41/157），而住院部腹泻患儿NoV的阳性率是11.11%(18/162)，统计学分析二者差别有统计学意义，说明该病发病急，自限性，恢复快，大多数病人选择门诊就医。二、NoV基因II型荧光定量RT-PCR检测方法的建立和评估NoV GII荧光定量RT-PCR扩增所使用的引物进行普通RT-PCR反应，2%的琼脂糖凝胶电泳显示，在98bp处有特异性条带，没有其他非特异性扩增。该引物和探针荧光定量RT-PCR检测荧光扩增曲线呈典型的光滑的S型曲线。构建的质粒DNA的纯度好，浓度高，经过体外转录纯化得到cRNA，cRNA的OD值位于1.7~2.0中间，纯度较好，浓度均值为321.83μg/ml。标准曲线的斜率是-3.41，截距是49.79，相关系数（R2）是0.998。此方法经过灵敏度检测，结果显示敏感性好，最低可以检出102拷贝数/μl的已知浓度RNA标准品样本。此方法能够特异地检出NoV基因II型，与NoV GI型无交叉反应，与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应。针对标准品的批内试验的Ct值变异系数（CV）分别为1.60%、0.70%，批间试验的变异系数（CV值）分别为0.40%、0.40%，均在5%以下，说明该体系稳定，重复性良好。三、氯对水中NoV的消毒研究RT-PCR结果显示，NV3R/NV3F引物对扩增条带最先消失；其次，随着氯的消毒剂量增大，COG2F/G2-SKR引物对扩增条带消失；而后，当氯的消毒剂量从5mg/L到10mg/L时，NV5R/NV5F引物对扩增条带消失。由此，我们认为，在三个不同的扩增中，消毒剂液氯可能优先损伤了NoV核酸的3’端，之后是ORF1与ORF2的结合区，而后损伤了5’端。PH7.2，室温下，浓度为1mg/L的氯作用下，基于引物COG2F/G2-SKR的荧光定量PCR检测显示，NoV的减少率在20min达到2.16log10。随着氯浓度的增加，在氯浓度5mg/L的时候NoV的减少率在5min可达到2.24log10，在20min达到3.01log10。结论：1、2009年10~11月天津市儿童医院腹泻患儿中存在NoV所致的病毒性腹泻，并且NoV是导致腹泻的主要病原体；腹泻患儿存在不同基因型别的NoV感染,NoV GII-4的2006b变异株是主要的流行优势株。2、我们建立和优化了荧光定量RT-PCR检测NoV GII型的方法，该方法稳定、灵敏性、特异性和重复性良好，可用于突发公共卫生事件的快速检测。3、在NoV核酸的3’端、ORF1和ORF2的结合区和5’端三个不同的区域中，消毒剂液氯可能先损伤NoV的3’端，之后是ORF1和ORF2的结合区，随着氯的浓度增大时，损伤了NoV的5’端。随着氯使用浓度的增加， NoV的核酸减少率也在增加。

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-18
第一章 2009 年 10~11 月天津市儿童医院腹泻患儿粪便标本诺如病毒的检出情况分析  18-38
  第一节引言  18-19
  第二节实验材料与方法  19-25
  第三节实验结果  25-36
  第四节讨论  36-37
  第五节结论  37-38
第二章诺如病毒基因 II 型实时定量 RT-PCR 检测方法的建立  38-62
  第一节引言  38-39
  第二节实验材料与方法  39-51
  第三节结果  51-60
  第四节讨论  60-61
  第五节结论  61-62
第三章氯对水中人类诺如病毒的消毒研究  62-72
  第一节引言  62-63
  第二节实验材料与方法  63-66
  第三节结果  66-70
  第四节讨论  70-71
  第五节结论  71-72
讨论  72-76
参考文献  76-82
综述  82-89
  参考文献  86-89
发表文章  89-95
个人简历  95-96
致谢  96-97

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