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连续化酶膜耦合法制备高活性ACE抑制玉米肽研究

作　者: 黄文浩
导　师: 何慧
学　校: 华中农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 玉米肽超滤纳滤原发性高血大鼠(SHRs) 动力学模型一级结构
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

为了利用植物蛋白资源,提高大宗农产品的副产品——玉米黄粉的附加值,本文以玉米黄粉为原料,采用酶解和膜分离耦合技术对连续制备高活性血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备工艺进行了优化,采用纳滤技术进行脱盐；建立了碱性蛋白酶Alcalase连续酶解玉米蛋白动力学模型；考察了玉米ACE抑制肽的活性稳定性；用自发性高血压大鼠(SHR)模型研究了玉米肽(CP)体内降血压效果并对其作用机理进行了初步研究；并采用HPLC/MS/MS法对部分玉米肽的一级结构进行了鉴定。主要结果如下：1.酶膜反应器法动态制备ACE抑制玉米肽工艺优化Alcalase连续酶解玉米蛋白的最佳工艺为：温度45℃,循环速度5L/min,酶底比1.5%,料液比3%,在此操作条件下制得玉米肽的ACE抑制率为：89.82%,蛋白质回收率为73.48%,平均膜通量为83.52%；产品的ACE抑制率较问歇式水解工艺提高了20%以上。2.玉米活性肽的超滤分级及纳滤脱盐超滤处理得到的三个玉米肽级份(Mm<1 kDa、Mm<3 kDa、Mm<5 kDa)中,以Mm< 3 kDa的玉米肽级份的ACE抑制活性最高,其半抑制浓度最低(IC5o=0.29),相对于仅经过一次超滤处理的Mm<5 kDa级分来说,IC5o值降低了四倍。最佳纳滤脱盐操作条件为：在pH值为9,压力为8 bar,循环次数4的操作条件下,对玉米肽进行脱盐,处理后料液的ACE抑制率为86.77%,脱盐率为89.72%,纳滤处理前后玉米肽ACE抑制活性基本保持稳定。3.连续酶解动力学模型拟合得到了水解度与底物浓度及水解时间的关系式为：参照此方程,可预测其它底物浓度下的水解度随时间的变化趋势；并进一步建立了Alcalase连续水解玉米蛋白过程动力学模型：得到米氏常数4.玉米肽的稳定性及其体内降血压活性①本实验中得到的三种级分Mm< 1 kDa, Mm< 3 kDa和Mm< 5kDa对温度均具有良好的稳定性,能耐受100℃以内的热处理；各级份在pH=8左右稳定性良好。体外模拟消化试验结果显示,玉米肽具有一定的抵抗胃肠道消化酶消化的能力,其中Mm< 3kDa级份玉米肽在模拟消化前后,其活性均高于其它两个级分,经过胃肠消化酶消化后,仍能保持90%以上的ACE抑制活性。②在短期给药试验中,对SHR灌胃玉米肽及阳性对照卡托普利(Captopril)1h后,与模型对照组相比,玉米肽高低剂量组(100 mg/kg-bw)、中低剂量组(50mg/kg-bw)和低剂量组(25 mg/kg-bw)血压值均极显著降低(P<0.01),最大收缩压降幅分别为26.57 mmHg,19.57 mmHg和17.91 mmHg,高剂量组(100mg/kg-bw)降血压效果虽不及Captopril,但其降血压持续时间比Captopril长,从4h开始,高剂量组玉米肽组的降压效果略高于Captopril组,CP各剂量组可维持降血压效果5h左右。③在长期给药试验中,对SHR灌胃不同剂量玉米肽及阳性对照卡托普利(Captopril) 30 d后,CP各剂量组和阳性对照组(2 mg/kg-bw Captopril) SHR的血压值,均随着连续给药时间的延长,血压降幅不断增加。连续灌胃30d后,阳性对照组及CP高低剂量组(100 mg/kg-bw)、中低剂量组(50 mg/kg-bw)、低剂量组(25 mg/kg-bw) SHR其收缩压最大降幅分别下降39.39 mmHg、34.45 mmHg、30.95 mmHg和27.49 mmHg;而对血压正常的Wistar-Kyoto大鼠,长期灌胃高剂量(100 mg/kg-bw)玉米肽后血压值无显著变化。④Captopril和CP主要通过抑制肺脏和睾丸组织中ACE酶活,起到降血压作用,肺和睾丸是CP和Captopril作用的主要靶器官,且CP高剂量组(100 mg/kg-bw)的抑制效果略高于Captopril (2 mg/kg-bw)。5.玉米ACE抑制肽的结构初探经HPLC-MS/MS在线分离,结合蛋白质数据库信息比对,新鉴定了三种源于Mm<3kDa级分的玉米肽,其氨基酸序列分别为QQLLPF、QQFLPF和QLLPF,这三种小肽均富含疏水性氨基酸,氮端和碳端的前三个氨基酸均相同,用现有的构效关系理论分析,均为ACE抑制肽。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
缩略语表  12-13
第一章绪论  13-23
  1.1 生物活性肽  13-15
    1.1.1 生物活性肽的吸收机制  14-15
  1.2 血管紧张素转化酶与高血压  15-16
    1.2.1 高血压  15-16
    1.2.2 血管紧张素转化酶对血压的调控机制  16
  1.3 血管紧张素转化酶抑制剂  16-18
    1.3.1 人工合成ACE抑制剂  16-17
    1.3.2 食源性ACE抑制肽  17-18
      1.3.2.1 玉米蛋白源ACE抑制肽  18
  1.4 ACE抑制肽的作用机制  18-19
  1.5 生物活性肽的制备、分离与纯化  19-22
  1.6 本课题的意义  22-23
第二章酶膜反应器制备玉米肽工艺优化  23-35
  2.1 材料与方法  24-28
    2.1.1 材料  24
    2.1.2 实验方法  24-28
  2.2 结果与分析  28-32
    2.2.1 温度对Alcalase酶活及其酶稳定性的影响  28
    2.2.2 制备工艺优化  28-32
  2.3 讨论  32-34
  2.4 本章小结  34-35
第三章玉米活性肽的超滤分级及纳滤脱盐工艺研究  35-45
  3.1 材料和方法  36-39
    3.1.1 材料  36-37
    3.1.2 方法  37-39
  3.2 结果与分析  39-41
    3.2.1 酶膜耦合技术连续制备玉米肽ACE抑制活性稳定性  39
    3.2.2 超滤后各个级份玉米酶解肽的ACE抑制活性比较  39-40
    3.2.3 纳滤脱盐工艺优化  40-41
  3.3 讨论  41-44
    3.3.1 超滤分级分离对玉米肽活性的影响  41-42
    3.3.2 不同纳滤处理方法对玉米肽脱盐率及活性的影响  42-44
  3.4 本章小结  44-45
第四章碱性蛋白酶连续酶解玉米蛋白动力学模型研究  45-56
  4.1 材料与方法  46-47
    4.1.1 实验材料  46
    4.1.2 实验方法  46-47
  4.2 结果与分析  47-53
    4.2.1 水解度DH的拟合  47-51
    4.2.2 连续酶解过程动态模型  51-53
  4.3 讨论  53-54
    4.3.1 动力学模型研究的意义  53-54
  4.4 本章小结  54-56
第五章玉米肽的稳定性及其体内降血压活性研究  56-70
  5.1 材料与方法  57-60
    5.1.1 材料  57-58
    5.1.2 方法  58-60
  5.2 结果与分析  60-66
    5.2.1 玉米肽ACE抑制活性稳定性  60-63
    5.2.2 短期服用玉米肽对原发性高血压大鼠血压的影响  63-64
    5.2.3 长期服用玉米肽对原发性高血压大鼠血压的影响  64-65
    5.2.4 长期服用玉米肽对SHR组织内源性ACE活性的影响  65-66
  5.3 讨论  66-68
    5.3.1 不同级分玉米肽的体外模拟消化稳定性  66-67
    5.3.2 玉米肽的体内降血压活性  67-68
    5.3.3 玉米肽降血压活性作用机理初探  68
  5.4 本章小结  68-70
第六章 ACE抑制玉米肽结构及其构效关系初探  70-80
  6.1 材料与方法  71-72
    6.1.1 实验材料  71
    6.1.2 实验方法  71-72
  6.2 结果与分析  72-78
    6.2.1 玉米肽(Mm  72-78
  6.3 讨论  78-79
  6.4 本章小结  79-80
结论与展望  80-82
参考文献  82-91
致谢  91-92
附录(攻读硕士学位期间发表的论文)  92

连续化酶膜耦合法制备高活性ACE抑制玉米肽研究

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