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RABV街毒株感染导致神经细胞骨架及递质异常相关基因的筛选和验证

作　者: 乔斌
导　师: 张茂林
学　校: 吉林大学
专　业: 预防兽医学
关键词: RAVB 街毒株细胞骨架神经递质神经元
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

狂犬病是一种高度致死性的人兽共患传染病。狂犬病病毒(RABV)街毒株感染的临床表现为明显的神经症状，而细胞骨架是维持细胞正常形态及物质运输的关键。为此本研究首先筛选了RABV街毒株，然后对其在不同脑区RABV糖蛋白基因的表达水平及RABV的分布进行了检测，并分析了海马区细胞骨架相关基因的表达变化，以期为RABV街毒株致神经功能异常提供理论依据。本研究首先对实验室保存的4株RABV（2株街毒株PB3、SX和2株固定毒株3aG、CVS）的糖蛋白基因进行了测序，推导的氨基酸序列显示，2株街毒株（PB3、SX）糖蛋白信号肽同源性为100%，2株固定毒株（3aG、CVS）之间的同源性为84.2%，街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9%和73.7%，比较还发现2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同，街毒株信号肽的二级结构和疏水值与常用疫苗株和固定株间均存在明显差异,并观察到在247位糖基化位点发生了N（Asn）→D（Asp）替代。随后将20只8-12g C57BL/6小鼠随机分为两组，实验组脑内接种街毒株PB3，每只鼠的接种量为10MICLD50/30μL，对照组小鼠接种相同体积的C57BL/6鼠脑研磨液。取实验组发病濒死期和对照组的不同脑区，通过荧光定量分析鼠脑不同区域G基因的表达量，并与免疫组化检测到的病毒分布情况进行比较。结果显示实验组鼠脑不同区域中G基因拷贝数依次为：大脑皮层＞海马、脑干＞小脑＞丘脑＞嗅球，这些变化规律与免疫组化检测到的抗原分布结果相一致。采集实验组发病濒死期和对照组鼠的海马组织，应用实时荧光定量对初步挑选的40个与细胞骨架及递质相关基因的体内表达水平进行了检测，同时在体外培养胎鼠的海马神经元上进行验证。结果显示， stmn1(↓)、katna1(↑)、mylk (↑)、gelsolin (↑)、kif5b(↓)、APC(↑)、klc1(↓)、Gsk3β(↑)等基因的体内外表达水平变化趋势一致，而stmn1、katna1、APC、Gsk3β的上述变化改变细胞内微管的稳定性，而gelsolin、mylk的如上变化导致细胞内微丝不稳定性，Kif5b、klc1基因的变化影响了神经因子及囊泡的运输。MLCK的变化导致肌动蛋白结构发生改变及神经递质释放异常。对PB3感染的海马组织的超微结构研究还发现，神经元线粒体肿胀，嵴消失，高尔基体亢进，核周隙扩大，突触体内出现含狂犬病病毒的突触小泡。以上这些变化说明RABV街毒株可使神经元超微结构改变，细胞骨架破坏，进而影响到递质的传输及释放，为RABV致神经功能异常的阐述提供了较好的数据支持。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
第一篇文献综述  12-19
  1.1 狂犬病病毒致病机制的研究进展  12-15
  1.2 细胞骨架及其在 RABV 感染后的变化  15-19
第二篇研究内容  19-61
  第1章四株狂犬病病毒糖蛋白序列分析  19-26
    1 材料与方法  19-21
      1.1 材料  19-20
      1.2 方法  20-21
    2 结果  21-24
      2.1 RABV 糖蛋白基因的 RT－PCR 扩增及序列测定  21-22
      2.2 糖蛋白基因推导的氨基酸序列比较  22
      2.3 与常用疫苗株糖蛋白信号肽区氨基酸的比较  22-23
      2.4 糖蛋白信号肽区二级结构预测及疏水值  23-24
    3 讨论  24-25
    4 小结  25-26
  第2章街毒株感染鼠脑不同脑区 G 基因表达量及抗原分布  26-35
    1 材料和方法  26-30
      1.1 材料  26-27
      1.2 方法  27-30
    2 结果  30-33
      2.1 不同鼠脑区 RNA 浓度的测定  30-31
      2.2 街毒株感染鼠不同脑同区糖蛋白 G 基因拷贝数及抗原分布  31-33
    3 讨论  33-34
    4 小结  34-35
  第3章神经细胞骨架及递质相关异常基因的筛选和验证  35-54
    1 材料和方法  35-43
      1.1 材料  35-36
      1.2 方法  36-43
        1.2.1 狂犬病病毒街毒株接种鼠脑  36
        1.2.2 原代神经元培养  36-38
        1.2.3 小鼠原代神经元感染狂犬病病毒  38-39
        1.2.4 海马组织和神经元细胞 RNA 的提取  39
        1.2.5 海马组织 RNA 逆转录反应  39
        1.2.6 基因的挑选和引物的设计  39-41
        1.2.7 采用 PCR 方法验证设计的引物  41-42
        1.2.8 挑选基因的 Real-Time PCR 扩增  42
        1.2.9 于冰上配置 Real Time PCR 混合液  42
        1.2.10 挑选基因的相对定量  42
        1.2.11 透射电镜样子处理  42-43
    2 结果  43-51
      2.1 小鼠海马提取的 RNA 及神经元提取 RNA 浓度测定  43-45
      2.2 挑选基因引物的验证  45-47
      2.3 原代神经元细胞培养、鉴定及狂犬病病毒街毒株 PB3 感染  47-48
      2.4 PB3 感染海马组织及海马神经元的超微结构研究  48-49
      2.5 体内、体外变化趋势一致的差异基因的筛选  49-51
    3 讨论  51-52
    4 小结  52-54
  第4章细胞骨架及递质异常相关的 MYLK (肌球蛋白轻链激酶)和GELSOLIN 蛋白(凝溶胶蛋白)验证  54-61
    1 材料和方法  54-58
      1.1 材料  54-55
      1.2 方法  55-58
    2 结果  58-59
    3 讨论  59-60
    4 小结  60-61
结论  61-62
参考文献  62-71
导师简介  71-72
作者简介  72-73
致谢  73-74

RABV街毒株感染导致神经细胞骨架及递质异常相关基因的筛选和验证

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