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狂犬病病毒街毒株感染致突触F-actin重构及其机制的研究

作　者: 宋艳
导　师: 孙连坤
学　校: 吉林大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 狂犬病毒街毒株突触肌动蛋白树突棘重构
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：狂犬病是由狂犬病病毒感染中枢神经系统引起的致死性人兽共患传染病。狂犬病致死原因与中枢神经异常兴奋密切相关，虽然人们认为神经兴奋性异常可引起神经元死亡，但是神经病理学检测却未见狂犬病病毒感染的神经元出现明显的形态学改变。突触是神经元特化的部位和信息传递的结构元件，树突棘是兴奋性突触后的成分，参与神经兴奋性的传导和可塑性的调节，由于肌动蛋白纤维（F-actin）是树突棘内的主要骨架成分，其重构能够改变树突棘的形态，并且影响到神经网络的兴奋性，为此，研究树突棘的变化可能为阐明狂犬病病毒感染致神经突触功能异常提供理论依据。本研究试图探讨狂犬病病毒感染后F-actin的重构，以期揭示狂犬病在树突棘水平发生和发展的病理学机制。方法：（1）体内接种实验：C57BL/6小鼠20只，随机分为实验组和对照组（每组10只），实验组脑内接种30μl（10TCID50） MRV病毒液，对照组脑内接种等量细胞维持液。1）利用抗MRV抗体检测病毒抗原在小鼠脑内的分布，常规HE染色和尼氏染色检测感染神经元缺失情况；2）利用MAP2抗体和MRV抗体免疫荧光分析感染后对神经元胞体和突起的影响；3）利用Alexa488-conjugated-Phalloidin检测海马F-actin的改变；4）荧光定量PCR分析12个与F-actin骨架变化相关的基因（包括cfll3，ssH1，gsn，ppp3a，limk，Pfn1）的表达来寻找与F-actin重构相关的蛋白；5）Western Blot检测cofilin和p-cofilin的表达水平以及F-actin/G-actin比值，进而分析F-actin动力学改变。（2）体外接种实验：体外小鼠原代海马神经元单独培养以及海马和皮层神经元共培养体系进行接种MRV病毒液。1）利用抗MRV抗体检测病毒抗原观察不同时间MRV感染情况；2）MRV感染96小时后，应用荧光标记的Phalloidin检测树突棘的变化；3）荧光定量PCR检测F-actin相关的基因（cfll3，ssH1，gsn，ppp3a；limk，Pfn1）在感染细胞内的变化；4）在蛋白水平上检测MRV感染原代神经细胞后cofilin和p-cofilin的表达水平，以及F-actin/G-actin比值，进而分析F-actin动力学改变。（3）F-actin解聚相关分子信号途径的进一步探讨：1）海马突触神经体提取实验：采用电镜和Western blot技术对提取的突触体进行鉴定，利用Pull down和Western blot检测突触体蛋白来分析MRV感染对小GTPaseRhoA、Rac1和Cdc42的影响；2）为了检测MRV感染对Rac-PAK-cofilin信号途径的影响，我们用Western blot检测Rac下游的信号（即p-PAK，p-cofilin）以及它们的总体表达水平。结果：（1）体内接种实验：1）MRV感染小鼠病毒抗原的脑内分布：通过抗MRV抗体和免疫组织化学实验检测病毒抗原显示，病毒抗原广泛分布在小鼠海马、大脑皮层、小脑、丘脑和延髓等部位。统计数据表明海马是病毒感染量最多的部位之一，在海马CA1、CA2和CA3区均可见病毒阳性细胞。2）MRV感染脑内神经元的改变：HE染色和尼氏染色未见明显的神经元缺失，MAP2抗体和MRV抗体免疫荧光分析感染后对神经元胞体和突起的影响显示，小鼠海马CA1区神经元胞体和神经元突起未发生变化。3）MRV感染脑内F-actin的改变：发病小鼠海马CA1区F-actin荧光强度降低，F-actin阳性结构与对照组相比数量显著减少（p<0.01，t-test）。同时发现，F-actin沿着树突重构形成杆状的结构。双重荧光标记分析显示，这些杆状结构是F-actin在突触后膜重新分布引起的。4）MRV感染脑内F-actin重构机制：我们选取了12个与骨架变化相关的基因，荧光定量PCR检测显示，cfll3，ssH1，gsn，ppp3a等基因表达上调，与此相对，limk和Pfn1基因表达下调。这些出现变化的基因与F-actin解聚或聚合密切相关。其中cfll3（即cofilin蛋白的基因）是上调最明显的基因，cofilin激活后，其磷酸化水平（p-cofilin）减低，从而使F-actin解聚。5）F-actin动力学改变：实验组F-actin和G-actin的强度和比值与对照组比较明显降低；实验组cofilin表达量不变，但是磷酸化水平（p-cofilin）增加。（2）体外接种实验：1）原代海马神经元MRV感染时间规律：免疫荧光观察不同时间MRV感染显示，MRV感染96小时，阳性细胞数最多，故以此作为后续实验MRV感染的时间点。2）树突棘的改变：原代海马神经元和皮层神经元共培养体系感染MRV病毒96小时后，Phalloidin标记显示树突上出现蘑菇状成熟的树突棘，与对照组细胞树突棘（12±3.0/um，n=10，p<0.01，t-test）相比，感染细胞的树突棘的数量显著降低（4±2.0/um n=12）。此外，MRV感染的海马神经元F-actin的荧光强度与对照组相比也明显降低。3）MRV感染脑内F-actin重构机制：荧光定量PCR检测F-actin相关基因显示：上调均较明显的基因为cfll3，ssH1，gsn，ppp3a；下调均较明显的基因为limk和Pfn1。上调明显的基因与F-actin解聚有关，而下调明显的基因与F-actin聚合有关，此结果与体内结果一致。4）F-actin动力学改变：实验组F-actin和G-actin的强度和比值与对照组比较明显降低；实验组cofilin表达量不变，但是p-cofilin表达降低。（3）与F-actin重构相关Rac下游信号的分析1）海马突触神经体实验：提取的突触体经过电镜和western blot鉴定后，采用Pulldown和Western blot检测突触体蛋白发现，MRV感染使GTPase Rac的活性显著降低，Cdc42的活性降低，但是对RhoA的活性没有影响。2）与F-actin重构相关Rac下游信号的分析：PAK和cofilin是Rac下游的信号，蛋白质分析显示尽管MRV感染没有引起总PAK和cofilin明显变化，但是p-PAK和p-cofilin的表达量显著降低。结论：我们的体内和体外实验结果表明：狂犬病病毒感染虽然没有引起显著的神经元死亡，但是却能导致突触后树突棘数量明显下降。通过分析与F-actin动力学相关的信号途径，我们发现MRV感染抑制了GTPase Rac1的活性，引起p-PAK和p-cofilin降低，引起树突棘F-actin解聚，使树突棘的数量降低，该机制可能与狂犬病病毒导致的神经功能异常有关。这些发现进一步揭示了F-actin与狂犬病的关系，将有助于阐明狂犬病的发生和发展的机制。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-15
第1章文献综述  15-31
  1.1 狂犬病病毒感染与细胞骨架  15-23
    1.1.1 狂犬病的危害性  15
    1.1.2 狂犬病毒与神经细胞死亡  15
    1.1.3 狂犬病毒与神经功能异常  15-16
    1.1.4 突触的结构和功能  16-17
    1.1.5 F-actin 和 F-actin 结合蛋白  17-19
    1.1.6 调控 F-actin 解聚和聚合的信号途径  19-23
  1.2 树突棘与神经心理疾病  23-31
    1.2.1 树突棘形态的神经病理学研究  23-24
    1.2.2 基因和分子机制  24-29
    1.2.3 结论和展望  29-31
第2章狂犬病病毒街毒株 MRV 感染使小鼠海马 CA1 区树突棘减少及 F-actin 重构  31-55
  2.1 前言  31
  2.2 材料与方法  31-43
  2.3 实验结果  43-53
  2.4 讨论  53-54
  2.5 小结  54-55
第3章狂犬病病毒 MRV 感染导致原代海马神经元树突棘减少及 F-actin 解聚  55-67
  3.1 前言  55
  3.2 材料与方法  55-59
  3.3 实验结果  59-65
  3.4 讨论  65-66
  3.5 小结  66-67
第4章狂犬病毒街毒株感染抑制 Rac-PAK-cofilin 途径引起海马 CA1 区树突棘 F-actin 解聚  67-75
  4.1 前言  67
  4.2 材料与方法  67-69
  4.3 实验结果  69-72
  4.4 实验讨论  72-73
  4.5 小结  73-75
第5章结论  75-77
参考文献  77-95
作者在学期间所取得的科研成果  95-97
致谢  97

狂犬病病毒街毒株感染致突触F-actin重构及其机制的研究

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