学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

壳聚糖酶的分离纯化及酶基因在解脂耶氏酵母中的表达

作　者: 王娇
导　师: 刘万顺
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 壳聚糖酶分离纯化表达解脂耶氏酵母
分类号: Q814.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 73次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

壳寡糖具有许多独特的生理活性及功能性质,如增强机体免疫力、抗肿瘤、抑菌等,在医药、农业、食品等领域有着广泛的应用。壳聚糖酶是专一性降解壳聚糖的水解酶,可用于功能性壳寡糖的制备。本研究的主要目的是构建高效表达壳聚糖酶的工程菌株,以解决目前壳聚糖酶产量低、成本高等问题,同时为壳寡糖的制备提供有效途径。Microbacterium sp.是本实验室已筛选得到的产壳聚糖酶菌株,在此基础上,本论文报道了Microbacterium sp.壳聚糖酶的分离纯化、壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶的性质等研究。采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-100凝胶层析相结合的方法对Microbacterium sp.粗酶液进行了分离纯化,得到电泳纯壳聚糖酶B,纯化倍数为9.9,回收率为20.5%。SDS-PAGE凝胶电泳显示单一条带,其相对分子质量约为33.8 kDa。酶解产物质谱分析表明壳寡糖主要为四糖、五糖,部分二糖及三糖,无单糖,说明此酶为内切酶。酶N端氨基酸序列为ETAGTVDLDAPVQKDT。根据酶N端测序结果及已注册壳聚糖酶序列设计引物,以Microbacterium sp.基因组为模板扩增得到约1000 bp特异性片段,序列分析表明含有完整的壳聚糖酶编码基因,其开放阅读框为801 bp,编码266个氨基酸残基,属于糖苷水解酶46号家族。该基因前26个氨基酸为信号肽,其N端推导序列与测序结果一致。壳聚糖酶基因表达采用解脂耶氏酵母表达体系。目的基因与表达载体pINA1317经限制性内切酶SfiⅠ、KpnⅠ双酶切后,连接,构建重组载体。重组载体NotⅠ酶切线性化后转化Yarrowia lipolytica Polh。采用YNB平板筛选阳性转化子。菌落PCR表明目的基因整合入酵母基因组中。转化子接种于PPB培养基（蔗糖2 g,酵母粉0.132 g,氯化铵0.132 g,磷酸二氢钾0.032 g,无水硫酸镁0.0132 g,硫胺素0.0334 mg,溶于100 ml pH 7.0 100 mM柠檬酸盐缓冲液）,28℃培养120 h,发酵上清液酶活力可达10.4 U/ml,是Microbacterium sp.上清液酶活力的3.15倍。转化子粗酶液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析得到电泳纯重组壳聚糖酶。SDS-PAGE及Western blotting鉴定了重组蛋白的表达,重组酶相对分子量偏大,为41kDa,可能与酵母表达体系的糖基化有关。酶学性质研究表明重组酶最适反应温度45℃,最适反应pH为5.6,缓冲体系为0.2 M乙酸盐缓冲液。重组酶在pH 5.0-7.0、25℃以下具有较好的稳定性。Na⁺对酶活力有一定的促进作用;Ag⁺、Fe³⁺具有较强的抑制作用,其中Fe³⁺（5 mM、10 mM）、Ag+（10 mM）完全抑制酶活力。以壳聚糖为底物,重组酶的Km值为0.926 mg/ml,Vmax为6.15 U/ml。酶解产物主要为三糖、五糖,降解专一性较好。本研究通过构建相关表达载体及工程菌株,实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,并对表达蛋白进行了相关的生物活性鉴定,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章前言  12-28
  1 壳聚糖与壳寡糖概述  12-14
  2 壳寡糖的制备  14-15
  3 壳聚糖酶研究进展  15-22
    3.1 壳聚糖酶的发现与来源  15
    3.2 壳聚糖酶的分类  15-17
    3.3 壳聚糖酶的性质  17-19
    3.4 壳聚糖酶的分子生物学研究  19-21
    3.5 壳聚糖酶的功能及应用  21-22
  4 解脂耶氏酵母表达系统  22-27
    4.1 宿主菌  23
    4.2 表达载体  23-26
    4.3 外源蛋白高效表达策略  26-27
  5 研究内容及意义  27-28
第二章壳聚糖酶的分离纯化  28-38
  1 材料与仪器  28-29
    1.1 菌株  28
    1.2 材料与试剂  28-29
    1.3 主要仪器设备  29
  2 实验方法  29-33
    2.1 壳聚糖酶活力的测定  29-31
    2.2 蛋白质浓度的测定  31-32
    2.3 壳聚糖酶的纯化  32
    2.4 壳聚糖酶分子量的测定  32-33
    2.5 壳聚糖酶N-端测序  33
    2.6 酶解产物分析  33
  3 实验结果  33-37
    3.1 壳聚糖酶的纯化  33-35
    3.2 壳聚糖酶分子量测定  35-36
    3.3 壳聚糖酶N 端测序  36
    3.4 酶解产物分析  36-37
  4 小结  37-38
第三章壳聚糖酶基因的克隆及序列分析  38-45
  1 材料与试剂  38-39
    1.1 试剂  38
    1.2 培养基  38
    1.3 菌株与质粒  38-39
    1.4 主要仪器  39
  2 实验方法  39-41
    2.1 基因组的提取  39
    2.2 引物设计  39-40
    2.3 PCR 扩增  40
    2.4 重组质粒的构建  40-41
    2.5 感受态细胞的转化  41
  3 实验结果  41-44
    3.1 壳聚糖酶基因的获得  41-42
    3.2 壳聚糖酶基因序列分析  42-44
  4 小结  44-45
第四章壳聚糖酶基因的表达  45-58
  1 实验设计  45-47
    1.1 表达载体pINA1317 及其宿主菌Polh  45-46
    1.2 实验路线  46-47
  2 材料与试剂  47-48
    2.1 试剂  47
    2.2 培养基  47
    2.3 菌株与质粒  47-48
  3 实验方法  48-53
    3.1 壳聚糖酶基因的扩增  48-49
    3.2 重组表达质粒的构建  49-51
    3.3 Po1h 感受态细胞的转化  51-53
  4 实验结果  53-57
    4.1 重组表达质粒的构建  53-54
    4.2 线性转化片段的制备  54
    4.3 Y.lipolytica Polh 转化  54-57
  5 小结  57-58
第五章重组壳聚糖酶的性质研究  58-66
  1 材料与试剂  58
    1.1 培养基  58
    1.2 试剂  58
  2 实验方法  58-60
    2.1 培养条件测定  58-59
    2.2 重组酶的纯化  59
    2.3 SDS-PAGE 分析  59
    2.4 免疫印迹鉴定  59
    2.5 重组酶的性质研究  59-60
  3 实验结果  60-65
    3.1 培养条件测定  60-61
    3.2 重组酶的纯化  61-62
    3.3 重组酶的鉴定  62-63
    3.4 重组酶的性质研究  63-65
  4 小结  65-66
总结  66-68
参考文献  68-76
致谢  76-77
个人简历  77
发表的学术论文  77

壳聚糖酶的分离纯化及酶基因在解脂耶氏酵母中的表达

内容摘要

全文目录

相似论文