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香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析

作　者: 杨浩
导　师: 杜中军; 唐志鹏
学　校: 广西大学
专　业: 果树学
关键词: 香蕉 cDNA克隆 ARF3基因遗传转化基因功能表达载体
分类号: S668.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

ARF3基因属于ARF基因家族的成员,该基因比较保守,主要功能是控制细胞内物质的转运。本研究以巴西蕉为材料,分离克隆了ARF3基因cDNA全长序列,并对其生物信息学进行了分析,在此基础上构建了Cam35s-gfp-gus-ARF3表达载体,该载体同时含有绿色荧光蛋白和GUS报告基因,可以更准确的检测转基因植株。通过农杆菌介导的方法将ARF3基因转入烟草基因组中,并对转基因植株进行了检测,对其功能进行了分析和鉴定。得出的主要结果如下：1、香蕉RNA提取方法的优化。在前人基础上,对香蕉RNA提取方法作了改进,优化后的方法比较适用于香蕉不同器官RNA的提取,并且提取的RNA量度大、条带清晰、无污染及完整性较好,可以较好满足下游实验的需要。2、香蕉ARF3基因cDNA全长克隆及生物信息学分析。利用RACE方法首次获得了香蕉的ARF3基因cDNA全长。该基因全长1427bp,编码338个氨基酸,推测蛋白质分子质量为38.24KD,等电点为5.36。开放阅读框为1166bp,其中起始密码子位于174bp,终止密码子位于1340bp。香蕉ARF3基因核苷酸序列与其它植物ARF基因核苷酸序列具有69%-74%的相似性,氨基酸序列有81%-93%的相似性。3、ARF3基因在香蕉不同器官中表达特性分析。利用半定量RT-PCR方法分析其表达特性,结果表明：香蕉ARF3基因的表达量在叶片中最高,其次是根系,茎中的表达量最低。4、香蕉组织培养体系的优化。分别采用香蕉雄花序、茎尖生长点和茎段横切薄片三种外植体材料进行组织培养,经过综合比较得出的结果为：采用茎段横切薄片繁殖无菌香蕉苗具有操作简单、外植体污染率低、培育周期短等优点,可以较快繁殖出大量的香蕉组培苗,从而满足实验的需要。5、表达载体的构建及遗传转化体系的优化。利用载体Cam35s-gfp-gus上Sac Ⅰ和BamH Ⅰ两个限制性内切酶,将目的基因插入到多克隆位点区,从而完成载体的构建。在遗传转化体系优化过程中,筛选出卡那霉素的致死浓度为400mg/L,半致死浓度为200mg/L;抗性培养基中羧苄青霉素的浓度为500mg/L时可以很好地抑制农杆菌的生长；农杆菌侵染时间在15min,菌液浓度OD600值为0.8时转化效率最高。6、转基因植株的检测及功能分析。提取烟草的DNA和RNA,利用特异性引物扩增对阳性植株进行检测；利用GUS报告基因对香蕉ARF3基因在烟草中的瞬时表达进行检测；利用绿色荧光蛋白报告基因对阳性植株进行检测。结果表明：阳性转化率达到近80%；染色反应过程中,烟草的叶片出现蓝色斑块；利用荧光显微镜可以明显地看到烟草局部叶肉细胞有较强绿色荧光发出。转基因的烟草与对照相比,呈现生长速度快、植株高大、叶色浓绿、叶面积显著增加的特点。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
1 前言  12-18
  1.1 香蕉生产概述  12
  1.2 生物技术在香蕉上的应用  12-14
    1.2.1 转基因技术在香蕉上的应用研究  12-13
    1.2.2 组织培养技术在香蕉上的应用研究  13-14
  1.3 ARF基因研究  14-17
    1.3.1 ARF基因结构  14-15
    1.3.2 ARF基因功能  15
    1.3.3 ARF基因表达特性  15-16
    1.3.4 ARF基因作用机制  16-17
  1.4 本研究目的和意义  17-18
2 材料与方法  18-32
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 植物材料  18
    2.1.2 实验试剂与药品  18
    2.1.3 载体与菌株  18
    2.1.4 实验仪器设备  18-19
  2.2 实验方法  19-32
    2.2.1 香蕉总RNA的提取  19
    2.2.2 cDNA单链的合成  19-20
    2.2.3 香蕉ARF3基因全长克隆  20-23
    2.2.4 香蕉ARF3基因的生物信息学分析  23
    2.2.5 香蕉ARF3基因的半定量表达分析  23
    2.2.6 香蕉组织培养体系的优化  23-24
    2.2.7 培养基的配制  24-25
    2.2.8 实验所用引物序列  25
    2.2.9 实验用维生素及抗生素配制  25-26
    2.2.10 香蕉ARF3基因表达载体的构建  26-29
    2.2.11 表达载体转化农杆菌  29-30
    2.2.12 遗传转化体系中各因素的优化  30
    2.2.13 烟草的遗传转化和植株的再生  30-32
3 结果与分析  32-51
  3.1 香蕉总RNA的提取  32
  3.2 香蕉ARF3基因的全长克隆  32-34
  3.3 香蕉ARF3基因序列分析  34-37
  3.4 香蕉ARF3基因的相似性分析  37
  3.5 香蕉ARF3基因在不同器官的表达量分析  37-38
  3.6 香蕉不同外植体的组织培养分析  38-39
  3.7 香蕉ARF3基因表达载体构建分析  39-41
  3.8 表达载体转化农杆菌的分析  41-42
  3.9 遗传转化体系中各因素优化分析  42-44
    3.9.1 羧苄青霉素(Cb)浓度筛选分析  42
    3.9.2 卡那霉素(Kan)基础抗性筛选分析  42-43
    3.9.3 农杆菌侵染时间的分析  43
    3.9.4 农杆菌侵染菌液浓度的分析  43-44
  3.10 烟草的遗传转化及植株再生  44-46
  3.11 转基因烟草的检测  46-49
    3.11.1 GUS辅助检测分析  46
    3.11.2 荧光检测分析  46-47
    3.11.3 PCR检测分析  47-49
  3.12 转基因烟草的表现性状分析  49-51
4 讨论  51-55
  4.1 香蕉ARF3基因序列及表达差异研究  51-52
  4.2 香蕉不同外植体组织培养特性的研究  52
  4.3 遗传转化体系中各因素优化研究  52-53
    4.3.1 羧苄青霉素(Cb)浓度筛选  52-53
    4.3.2 卡那霉素(Kan)浓度筛选  53
    4.3.3 农杆菌侵染时间  53
    4.3.4 菌液浓度筛选  53
  4.4 香蕉ARF3基因的功能研究  53-55
5 结论  55-56
  5.1 香蕉ARF3基因克隆及表达特性分析  55
  5.2 香蕉不同外植体组织培养特性比较  55
  5.3 遗传转化体系中各因素优化比较  55
  5.4 转基因烟草的表现性状  55-56
致谢  56-57
参考文献  57-61
附录A  61-62
附录B  62-63

香蕉ARF3基因的克隆及功能特性分析

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