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柑橘耐盐性分析和氯离子转运相关基因的功能鉴定

作　者: 魏清江
导　师: 彭抒昂
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘 盐胁迫 氯离子通道 阳离子氯离子共转运蛋白
分类号: S666
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


柑橘是一种重要的经济作物,但对盐胁迫较为敏感,尤其对含氯的盐分敏感。柑橘在盐胁迫下会积累大量的Na+和Cl-,导致植株光合下降、生长变缓并最终降低产量和果实品质。前人对柑橘耐盐性的研究主要集中在砧木上,而对不同柑橘品种间耐盐性的研究较少。此外,尽管Cl-转运在柑橘耐盐中起重要作用,但参与Cl-转运相关基因的研究还很缺乏。本研究比较了四个常见柑橘品种对NaCl胁迫的生理响应,分析了四个C1-转运相关的基因在这些盐胁迫品种叶片中的表达。此外,本研究在枳中克隆了其中的两个基因：PtrCLC和PtrCCC,并分析了基因的表达模式。为进一步研究基因在Cl-平衡中的作用,我们还将PtrCLC和PtrCCC分别在模式植物中进行了过表达,并分析了转基因植株和对照植株在盐胁迫下的表现。本研究的主要结果如下：1.比较了枳砧甜橙(纽荷尔和伦晚)和宽皮柑橘(鄂柑一号和国庆一号)对不同浓度NaCl (0、30、60和90mmol/L)胁迫的生理响应。结果表明：盐胁迫导致植株的干重、叶面积和净光合速率下降,但宽皮柑橘的下降幅度较小。与甜橙相比,宽皮柑橘叶片中积累的Na+和Cl-较低,而两种离子在植株根中的积累量较高。盐胁迫也导致品种间主要矿质元素含量的变化,而宽皮柑橘叶片中Ca和Mg的下降幅度低于甜橙。2.利用同源克隆法从枳中分离了一个CLC基因：PtrCLC。该序列包含2367bP的ORF,编码一个含789氨基酸的多肽。PtrCLC蛋白与其他物种CLC序列的一致性较高,该蛋白还含有10个跨膜区和两个CBS结构域。Real-time PCR分析表明PtrCLC在枳叶片和根中都有表达,同时该基因的表达在ABA、4℃和NaCl处理后上调。此外,在拟南芥AtCLCc突变体clcc中过表达35S::PtrCLC后发现,转基因植株的种子萌芽率在盐胁迫下得到提高。此外,在200mmol/L NaCl处理下,转基因拟南芥鲜重、电解质渗透和叶绿素含量的下降都小于突变体和野生型植株,并且转基因植株根部和地上部的C1-含量均低于突变体和野生型植株。3.为获得柑橘CLC基因家族的所有成员序列,我们用PtrCLC序列检索甜橙基因组数据库,共得到6个CLC基因序列。在枳中克隆验证了另外5个CLC基因。这6个CLC蛋白(PtrCLC1-6)长度在748-798个氨基酸之间,但成员之间序列差异较大。进化分析表明PtrCLCs可分为两个亚类,而PtrCLC4和PtrCLC6与细菌CLCs的关系相对较近。在大肠杆菌EcCLCA中,有三个与Cl-选择性吸收相关的位点：丝氨酸S107、谷氨酸E148和谷氨酸E203。序列比对发现,PtrCLC1在S107相对应位置为脯氨酸(P177), PtrCLC3在E148相对应位置为丙氨酸(A213),PtrCLC4和PtrCLC6在E203相对应位置分别为苏氨酸(T260)和丝氨酸(S295)。Real-timePCR分析表明PtrCLCs在枳叶片中偏好性表达,尤其是PtrCLC6.此外,我们分析了PtrCLCs对缺氮、NaC1和ABA处理的响应情况。缺氮后,PtrCLCs的表达都下调,而PtrCLCl在补充2mmol/L NO3-可后恢复表达。相反,NaCl处理导致PtrCLCs表达量增加,但PtrCLC2和PtrCLC4增加更明显,同时这两者也能够被ABA诱导上调表达。4.利用同源克隆法从枳中分离了一个CCC基因,PtrCCC。该序列长3438bp包含2943bP的ORF,编码一个含980氨基酸的多肽。PtrCCC蛋白含有11个跨膜区域。进化分析表明,PtrCCC与动物的KCC类转运蛋白进化关系较近。Real-timePCR分析表明PtrCCC在枳叶尖和根尖等幼嫩组织中的表达量高于成熟组织。此外,其表达能被KCl胁迫诱导上调。我们进一步将PtrCCC转入野生型烟草中进行基因的功能验证。在NaCl、KCl和NaCl+KCl胁迫下,转基因植株的生长表现都好于野生型植株。同时,在这三种盐胁迫尤其是在KCl胁迫下,转基因植株的根干重和地上部干重的积累都高于野生型植株。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-13
第一章 前言  13-29
  1 课题提出  13-14
  2 植物的盐害效应  14-17
    2.1 水分代谢  14-15
    2.2 植株生长  15
    2.3 盐离子毒害  15-16
    2.4 营养失衡  16-17
  3 植物对盐胁迫的适应机制  17-23
    3.1 盐胁迫信号转导  17-19
      3.1.1 Ca~(2+)信号途径  17-18
      3.1.2 ABA信号途径  18
      3.1.3 MAPK级联反应途径  18-19
    3.2 渗透调节物质的合成  19-21
      3.2.1 糖醇类  20
      3.2.2 氨基酸及其衍生物  20-21
    3.3 活性氧的清除  21
    3.4 离子平衡重建  21-23
      3.4.1 根部吸收  22
      3.4.2 木质部装载和韧皮部回流  22
      3.4.3 离子区域化  22-23
  4 离子转运蛋白与植物耐盐性  23-27
    4.1 Na~+转运蛋白  24-25
    4.2 K~+转运蛋白  25-26
    4.3 Cl~-转运蛋白  26
    4.4 阳离子氯离子共转运蛋白  26-27
    4.5 其它类型的离子转运蛋白  27
  5 本研究的内容、目的和意义  27-29
第二章 不同柑橘品种对NaCl胁迫的生理响应  29-42
  1 引言  29
  2 材料与方法  29-32
    2.1 试验材料和盆栽方法  29-30
    2.2 试验设计、采样和测定  30
    2.3 相关生理指标的测定  30-31
      2.3.1 气体交换参数测定  30
      2.3.2 元素含量测定  30-31
    2.4 基因表达的半定量分析  31-32
      2.4.1 植物组织RNA的提取和cDNA合成  31
      2.4.2 半定量RT-PCR分析  31-32
    2.5 统计分析  32
  3 结果与分析  32-37
    3.1 NaCl对植株生长的影响  32-34
    3.2 NaCl对钠和氯离子含量的影响  34-35
    3.3 NaCl对其他主要元素含量的影响  35-37
      3.3.1 NaCl对叶片元素含量的影响  35-36
      3.3.2 NaCl对根部元素含量的影响  36-37
    3.4 CitCLC、CitCCC、CitSLAC和CitICln基因的表达分析  37
  4 讨论  37-41
    4.1 不同品种对NaCl胁迫的响应存在差异  37-38
    4.2 钠和氯的分布与柑橘耐盐性  38-40
    4.3 其他元素的分布与柑橘耐盐性  40-41
    4.4 氯离子转运相关基因对盐胁迫的响应  41
  5 小结  41-42
第三章 枳PtrCLC基因的克隆与功能鉴定  42-60
  1 前言  42-43
  2 材料和方法  43-49
    2.1 植物材料和生长条件  43
    2.2 菌株与质粒载体  43
    2.3 枳PtrCLC基因的克隆  43-44
    2.4 基因序列分析  44-45
    2.5 基因表达分析  45
    2.6 拟南芥遗传转化  45-48
      2.6.1 载体构建  45-47
      2.6.2 农杆菌制备  47
      2.6.3 拟南芥的转化  47
      2.6.4 转基因拟南芥的抗性筛选  47
      2.6.5 转基因拟南芥的PCR检测  47-48
      2.6.6 转基因拟南芥的RT-PCR检测  48
      2.6.7 纯合体转基因拟南芥的筛选  48
    2.7 转基因拟南芥的耐盐性分析  48-49
    2.8 电导率和叶绿素测定  49
    2.9 元素含量测定  49
    2.10 统计分析  49
  3 结果与分析  49-57
    3.1 PtrCLC的克隆和序列分析  49-52
    3.2 PtrCLC的表达模式分析  52-53
    3.3 拟南芥转化及转基因植株的鉴定  53-54
    3.4 WT、clcc突变体和OE种子的萌芽率比较  54-55
    3.5 盐胁迫对WT、clcc和OE拟南芥幼苗生长的影响  55-56
    3.6 不同株系氯、钠和钾含量比较  56-57
  4 讨论  57-59
    4.1 PtrCLC具有CLC基因家族的基本特征  57-58
    4.2 PtrCLC能响应多种非生物胁迫  58
    4.3 过表达PtrCLC增加转基因拟南芥的耐盐性  58-59
  5 小结  59-60
第四章 枳CLC基因家族的克隆与表达分析  60-71
  1 前言  60-61
  2 材料和方法  61-62
    2.1 植物材料和生长条件  61
    2.2 枳中CLC基因家族成员的克隆  61-62
    2.3 序列分析  62
    2.4 基因表达分析  62
  3 结果与分析  62-68
    3.1 柑橘基因组中的CLC基因  62-63
    3.2 多序列比对和系统进化分析  63-66
    3.3 PtrCLCs在不同组织中的表达  66-67
    3.4 PtrCLCs在不同非生物胁迫下的表达  67-68
  4 讨论  68-70
    4.1 CLC基因家族在柑橘中的分布和序列特征  68
    4.2 PtrCLCs在枳各个组织中普遍存在  68-69
    4.3 PtrCLCs对胁迫的响应不同  69-70
  5 小结  70-71
第五章 枳PtrCCC基因的克隆与功能鉴定  71-82
  1 前言  71
  2 材料和方法  71-74
    2.1 植物材料和生长条件  71-72
    2.2 枳PtrCCC基因的克隆  72
    2.3 基因表达分析  72
    2.4 烟草的遗传转化  72-73
      2.4.1 载体构建  72
      2.4.2 试剂配制和培养基配方  72-73
      2.4.3 烟草转化过程  73
      2.4.4 转化烟草的鉴定  73
    2.5 转基因烟草的盐胁迫处理  73
    2.6 统计分析  73-74
  3 结果与分析  74-80
    3.1 PtrCCC的克隆和序列分析  74-76
    3.2 PtrCCC的表达模式分析  76
    3.3 转基因烟草的获得  76-78
      3.3.1 烟草的遗传转化和抗性筛选  76-77
      3.3.2 转基因烟草的分子鉴定  77-78
    3.4 不同盐分对野生型(WT)转基因(OE)烟草的影响  78-80
  4 讨论  80-81
    4.1 PtrCCC属于KCC类转运蛋白  80
    4.2 PtrCCC的表达特点  80-81
    4.3 转PtrCCC基因提高烟草的耐盐表现  81
  5 小结  81-82
参考文献  82-103
附录  103-104
  附录Ⅰ 课题资助  103
  附录Ⅱ 相关论文  103-104
致谢  104

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类
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