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核桃遗传转化体系的建立及rolB基因的导入

作　者: 李好先
导　师: 曹尚银
学　校: 中国农业科学院
专　业: 果树学
关键词: 核桃植株再生叶片培养 rolB基因农杆菌介导法
分类号: S664.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

核桃是一种难以生根的木本植物，且不同的品种间生根能力差异很大，这限制了苗木的工厂化生产和标准园种植，是核桃生产中迫切需要解决的关键问题，也是遗传改良的重要目标。本研究首先以“绿波”核桃的离体胚为材料进行无菌苗的培养，再以核桃茎段和叶片为外植体进行不定芽的诱导分化、生长发育及生根成苗试验。在不同的培养阶段采用不同的处理方法以及添加不同种类的不同质量浓度的植物生长调节剂组合，观察统计外植体材料在各个生长阶段和各种不同的培养基中的生长发育情况，筛选出最佳的处理方法和最优的激素配比，从而建立核桃的植株再生体系。在此基础上，在不定芽分化的培养基中添加不同浓度的卡那霉素和头孢噻肟霉素，观察抗生素对外植体生长的影响，以确定其最低致死质量浓度。然后构建植物表达载体，探讨农杆菌介导的rolB基因核桃的遗传转化条件，比较研究各种影响因素，选择合适的预培养时间、侵染时间、共培养时间和抗生素的浓度，建立核桃的遗传转化体系。最后，对筛选得到的转基因植株进行荧光蛋白检测和PCR检测，以验证rolB（root-inducing plasmid TL-DNA of locusB）基因的导入结果。研究结果和创新点如下：1.核桃离体胚培养：经过75%酒精30s+0.1%HgCl2（加0.1%吐温-80）5min消毒处理后，离体胚培养的萌发率最高（68.49%），在DKW基本培养基上获得最高的萌发率（84.56%）；在离体胚培养的第10天-第15天之间萌发率最高，之后不再增加。2.核桃茎段芽分化的最佳培养基组合是DKW+6-BA0.5mg/L+IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，再生率为2.96。3.核桃无菌苗生根培养：采用“两步生根法”，在诱导生根阶段的黑暗处理6-8天之间最好，黑暗处理6天时生根率为65.31%；在生根发育阶段蔗糖含量和氮浓度分别为40g/L、1416mg/L，生根率分别53.26%和45.14%。4.核桃叶片愈伤组织的培养：暗培养时间对叶片愈伤组织的形成影响较大，暗培养2周时叶片愈伤率可达100%，暗培养时间的增加（3周）会抑制叶片愈伤组织的形成；低浓度（2.0mg/L-4.0mg/L）TDZ促进叶片愈伤的形成，高浓度（8.0mg/L-12.0mg/L）的TDZ抑制叶片愈伤的形成，使愈伤组织的结构也变得更加疏松，同时也抑制了叶片和愈伤组织的褐化；生长素2,4-D、IBA和NAA对叶片愈伤组织的形成有积极的促进作用，但表现情况不同：低浓度（1.0mg/L）2,4-D促进叶片愈伤组织的形成，高浓度（2.0mg/L）抑制愈伤组织的形成；低浓度（0.01mg/L-0.5mg/L）的IBA有利于叶片愈伤组织的形成，高浓度（1.0mg/L）IBA不利于愈伤组织的形成；NAA在本试验浓度范围内（0.1mg/L-0.5mg/L）一直促进愈伤组织的形成。5. rolB基因植物表达载体的构建：通过NCBI GenBank查找发根农杆菌Ri质粒上的rolB基因cDNA序列，合成并修饰目的基因片段，限制性内切酶EcoRⅠ和BmaHⅠ进行双酶切质粒DNA，与带有标记基因YFP的表达载体PEZR(K)-LNY相连接，转化大肠杆菌感受态细胞，获得含有启动子CaMv35S的重组质粒。经过对重组质粒进行PCR和EcoRⅠ和BmaHⅠ双酶切鉴定，均获得825bp的目的片段，证明rolB基因的植物表达载体构建成功。6.利用农杆菌介导法转化核桃，结果表明：预培养10和15天后进行侵染，转化率达到3%和1.33%；用kan筛选不定芽，当kan质量浓度为0mg/L时，不定芽的诱导率达到90%，当kan质量浓度为100mg/L时，仅有极少数的不定芽的产生，且茎段逐渐黄化；当kan质量浓度为200mg/L和400mg/L时，外植体全部黄化死亡。因此，可用于转基因植株的筛选。以kan质量浓度为100mg/L作为常用的选择水平。7.转基因植株的鉴定：转化植株经过100mg/L kan和500mg/L cef筛选后，利用激光共聚焦显微镜对转化植株的活体叶片进行照射观察，可以看到细胞内有绿色荧光蛋白表达；经过进一步PCR扩增检测后，结果显示3株转化株系扩增出的特异性条带和阳性对照一致，说明外源基因已经整合到核桃基因组中。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
英文缩略表  13-14
第一章文章综述  14-26
  1.1 引言  14
  1.2 国内外研究现状  14-25
    1.2.1 核桃植物组织培养技术的发展  14-19
    1.2.2 核桃的生根研究现状  19-21
    1.2.3 rolB 基因的起源和作用  21-22
    1.2.4 核桃遗传遗传转化的方法  22-23
    1.2.5 向核桃中导入的基因  23-25
  1.3 本研究的主要内容和目的意义  25-26
第二章核桃茎段的植株再生及叶片愈伤组织的形成  26-46
  2.1 材料与方法  26-31
    2.1.1 试验材料  26-27
    2.1.2 试验方法  27-31
  2.2 结果与分析  31-43
    2.2.1 核桃离体胚培养消毒方法的选择  31
    2.2.2 核桃胚培养基本培养基的确定及萌发率的差异变化  31-33
    2.2.3 激素配比对‘绿波’核桃胚茎段不定芽分化的影响  33-34
    2.2.4 黑暗处理对‘绿波’核桃诱导生根的影响  34-35
    2.2.5 糖含量对‘绿波’核桃生根的影响  35-36
    2.2.6 氮浓度对‘绿波’核桃生根的影响  36
    2.2.7 暗培养时间对‘绿波’核桃叶片愈伤组织形成的影响  36-38
    2.2.8 TDZ 对‘绿波’核桃叶片愈伤组织形成的影响  38
    2.2.9 2,4-D 对‘绿波’核桃叶片愈伤组织形成的影响  38-40
    2.2.10 IBA 对‘绿波’核桃叶片愈伤组织形成的影响  40-41
    2.2.11 NAA 对‘绿波’核桃叶片愈伤组织形成的影响  41-42
    2.2.12 TDZ 和 IBA 激素组合对‘绿波’核桃叶片愈伤组织形成的影响  42-43
  2.3 讨论  43-46
    2.3.1 核桃胚培养基本培养基和消毒方法的选择  43-44
    2.3.2 胚培苗不定芽分化激素配比的选择  44
    2.3.3 影响生根的关键因素（暗培养时间、糖浓度、氮浓度）的筛选  44
    2.3.4 暗培养对叶片愈伤组织形成的影响  44-45
    2.3.5 TDZ 对叶片愈伤组织形成的影响  45
    2.3.6 2,4-D、IBA 和 NAA 对叶片愈伤组织形成的影响  45-46
第三章 rolB 基因植物表达载体的构建  46-57
  3.1 材料与方法  46-51
    3.1.1 试验材料  46-48
    3.1.2 试验方法  48-51
  3.2 结果与分析  51-56
    3.2.1 生物信息学分析结果  51-55
    3.2.2 植物表达载体的构建  55
    3.2.3 重组质粒的鉴定  55-56
  3.3 讨论  56-57
    3.3.1 线性载体的去磷酸化  56
    3.3.2 rolB 基因植物表达载体的构建  56-57
第四章农杆菌介导法进行 rolB 基因转化  57-64
  4.1 材料和方法  57-60
    4.1.1 试验材料  57-58
    4.1.2 试验方法  58-60
  4.2 结果与分析  60-62
    4.2.1 卡那霉素对‘绿波’核桃茎段不定芽分化的影响  60-61
    4.2.2 茎段预培养时间的选择  61
    4.2.3 转基因植株体内黄色荧光蛋白的鉴定  61-62
    4.2.4 PCR 检测  62
  4.3 讨论  62-64
    4.3.1 农杆菌介导法的选择  62
    4.3.2 抗生素的敏感性测定  62-63
    4.3.3 预培养的作用  63
    4.3.4 rolB 转基因植株的筛选和鉴定  63-64
第五章全文结论  64-65
参考文献  65-73
附录 A（图版）  73-78
附录 B  78-80
附录 C  80-81
致谢  81-82
作者简介  82

核桃遗传转化体系的建立及rolB基因的导入

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