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农杆菌介导小麦铁蛋白基因转化烟草及抗逆性研究

作　者: 陈静
导　师: 赵永亮
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 小麦铁蛋白农杆菌转基因烟草抗逆性
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

铁是生命活动过程中所必需的元素,而铁过量会导致氧化性胁迫,对细胞产生毒害,因此维持细胞内铁平衡非常重要。铁蛋白由于具有储铁和释铁的双重功能,是调节生物体内铁代谢平衡的关键蛋白。研究者们已从豌豆、苜蓿、拟南芥等许多植物中克隆出铁蛋白基因。其转基因研究集中在将外源铁蛋白基因导入植物,提高其抗逆性和铁含量。赵永亮等克隆出小麦铁蛋白基因(TaFer)并得到转基因酵母,发现其真核表达产物可有效清除3种活性氧。为深入了解TaFer在转基因应用中的功能,本研究构建烟草表达载体pBI121,通过农杆菌侵染法,将TaFer转入烟草,研究其抗逆性。根据Genebank序列AY864925设计引物,加入酶切位点及His标签。提取小麦总RNA,通过RT-PCR扩增TaFer,命名为Fn。Fn连接pGM-T克隆载体,转化后通过蓝白斑筛选,进行PCR、双酶切鉴定并测序,命名为Fn-pGM-T。 DNAStar软件分析测序结果显示,正确克隆出TaFer,且酶切位点与His标签插入正确。Fn-pGM-T双酶切,pBI121表达载体分步酶切,二者连接后转化,通过PCR和单酶切鉴定,命名为Fn-pBI121.Fn-pBI121转化农杆菌,PCR鉴定结果说明其成功转入农杆菌中。农杆菌活化后侵染烟草叶盘,筛选培养10天有绿色愈伤长出,1月左右将不定芽移至生根培养基,2周开始生根。RT-PCR结果显示TaFer已转入烟草中。GUS染色显示转基因苗中有GUS表达,提粗蛋白进行蛋白质电泳可见目的条带。T1代幼苗进行胁迫(干旱、盐、Cu2+)处理,测定胁迫前、胁迫10天和20天的各种生理生化指标。数据显示：干旱胁迫后转基因烟草的POD酶活、可溶性糖和脯氨酸含量高于野生型。盐胁迫后转基因烟草的可溶性糖含量、POD和CAT酶活高于野生型。Cu2+胁迫后转基因烟草的POD酶活和脯氨酸含量高于野生型。这些结果说明TaFer的转入能够提高烟草抗旱、抗盐和抗Cu2+胁迫的能力。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-12
第一章前言  12-18
  1.1 铁蛋白  12-14
    1.1.1 简介  12
    1.1.2 主要功能  12-13
    1.1.3 植物铁蛋白基因研究现状  13
    1.1.4 小麦铁蛋白基因研究现状  13-14
  1.2 烟草的转基因研究  14-15
    1.2.1 转基因烟草研究现状  14
    1.2.2 外源基因的导入技术  14-15
    1.2.3 转基因植株的检测与鉴定  15
  1.3 农杆菌侵染法  15-16
    1.3.1 原理  15-16
    1.3.2 农杆菌Ti质粒转化系统优点  16
    1.3.3 重组质粒导入农杆菌的方法  16
  1.4 植物抗逆性  16-17
    1.4.1 逆境对植物造成的伤害  16-17
    1.4.2 植物与环境胁迫相关的生理生化效应  17
  1.5 本研究的目的和意义  17-18
    1.5.1 目的  17
    1.5.2 意义  17-18
第二章转小麦铁蛋白基因烟草的获得与鉴定  18-40
  2.1 实验材料、试剂和仪器  18-25
    2.1.1 载体、菌种和材料  18-19
    2.1.2 实验主要试剂  19-24
    2.1.3 主要仪器  24-25
  2.2 小麦铁蛋白基因的克隆  25-31
    2.2.1 小麦总RNA提取  25-26
    2.2.2 cDNA第一链合成  26
    2.2.3 PCR  26-28
    2.2.4 扩增片段回收  28
    2.2.5 目的片段Fn与克隆载体pGM-T的连接  28
    2.2.6 连接产物的大肠杆菌转化  28-29
    2.2.7 重组质粒筛选与检测  29-31
  2.3 烟草表达载体的构建  31-34
    2.3.1 表达载体pBI121的分步双酶切  31-32
    2.3.2 目的基因与表达载体pBI121的连接  32
    2.3.3 连接产物大肠杆菌转化  32-33
    2.3.4 重组质粒筛选与检测  33-34
  2.4 烟草表达载体的农杆菌转化  34-35
    2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备  34
    2.4.2 感受态细胞的转化  34-35
    2.4.3 重组质粒筛选与检测  35
  2.5 转化烟草  35-37
    2.5.1 种烟草  35
    2.5.2 农杆菌活化  35
    2.5.3 转化  35-36
    2.5.4 培养与筛选  36-37
  2.6 转基因烟草T0代检测  37-40
    2.6.1 转录水平检测——RT-PCR  37
    2.6.2 GUS组织化学染色  37
    2.6.3 Western印迹  37-40
第三章转小麦铁蛋白基因烟草T1代抗逆性的初步研究  40-52
  3.1 种烟草  40
    3.1.1 处理  40
    3.1.2 发芽  40
    3.1.3 移栽  40
  3.2 干旱胁迫  40-51
    3.2.1 处理  40
    3.2.2 叶片相对含水量测定  40-41
    3.2.3 保护酶类活性测定  41-44
    3.2.4 可溶性蛋白质含量测定  44-46
    3.2.5 可溶性糖类含量测定  46-48
    3.2.6 脯氨酸含量测定  48-49
    3.2.7 丙二醛含量测定  49-51
  3.3 盐胁迫  51
    3.3.1 处理  51
    3.3.2 生理生化指标测定  51
  3.4 Cu~(2+)胁迫  51-52
    3.4.1 处理  51
    3.4.2 生理生化指标测定  51-52
第四章实验结果与分析  52-70
  4.1 小麦铁蛋白基因的克隆  52-55
    4.1.1 小麦总RNA提取  52
    4.1.2 PCR扩增  52
    4.1.3 重组质粒提取  52
    4.1.4 PCR鉴定  52-53
    4.1.5 双酶切鉴定  53
    4.1.6 测序结果  53-55
  4.2 烟草转化载体的构建  55-56
    4.2.1 载体pBI121分步双酶切  55
    4.2.2 重组质粒提取  55
    4.2.3 PCR鉴定  55
    4.2.4 单酶切鉴定  55-56
  4.3 pBI121-Fn重组质粒的农杆菌转化  56-57
    4.3.1 pBI121-Fn重组质粒提取  56-57
    4.3.2 PCR鉴定  57
  4.4 转基因烟草筛选和检测  57-60
    4.4.1 转基因烟草的筛选  57-58
    4.4.2 RT-PCR鉴定  58-59
    4.4.3 GUS组织染色  59-60
    4.4.4 Wertern印迹  60
  4.5 抗逆性研究结果与分析  60-70
    4.5.1 干旱胁迫结果与分析  60-65
    4.5.2 盐胁迫结果与分析  65-67
    4.5.3 Cu~(2+)胁迫结果与分析  67-70
第五章讨论  70-72
  5.1 关于植物组织培养与筛选的讨论  70-71
    5.1.1 筛选培养  70
    5.1.2 生根培养  70
    5.1.3 移栽  70
    5.1.4 Western印迹失败原因分析  70-71
  5.2 关于转TaFer烟草抗逆性研究的讨论  71-72
结论  72-73
参考文献  73-76
致谢  76-77
个人简历、在学习期间的研究成果及发表的学术论文  77

农杆菌介导小麦铁蛋白基因转化烟草及抗逆性研究

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