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农杆菌介导hrpZ_（Psg12）基因转化大豆的研究

作　者: 乔贞贞
导　师: 高洁
学　校: 吉林农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 甘薯双生病毒核苷酸序列外壳蛋白基因原核表达
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

甘薯是我国重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物,近年来甘薯的用途越来越受到人们的关注。甘薯受病毒侵染后,可造成甘薯产量下降、品质变劣,严重威胁甘薯生产。目前已报道的侵染甘薯的病毒至少有30种。研究表明,我国甘薯上至少存在甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)、甘薯病毒G (Sweet potato virus G, SPVG)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus, SPLV)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus, SPCFV)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic virus, SPVMV)和甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLC V)等8种病毒。双生病毒是近几年新发现的一类重要的DNA病毒,危害多种农作物,造成严重减产。目前对甘薯上双生病毒的研究还比较少,有关双生病毒在我国甘薯上的发生、分布及变异情况还不清楚。本研究利用PCR方法对我国主要甘薯产区存在的双生病毒种类进行了初步鉴定。利用双生病毒的通用引物BM-V/BM-C,采用PCR的方法对采自全国各地的30份甘薯样品进行了检测,其中,从7个样品中检测到双生病毒的存在并对7个样品的DNA-A全基因组核苷酸序列进行了克隆和序列测定,通过相似性对比发现7个分离物基因组核苷酸序列相似性在78.1%-99.6%之间,其中,SU-10-19与G-JIN-11-2的相似性最低,为78.1%；SU-10-3-2与SU-10-19的相似性最高,为99.6%。结果说明,不同地区的分离物基因组核苷酸序列的相似性较低,同一地区的分离物核苷酸序列相似性较高；根据双生病毒种及株系的划分标准,初步认为,其中G-YU-11-20和G-YU-11-26为同一病毒；SU-10-3-2和SU-10-19为同一病毒;其它三个分离物属于不同种病毒；将获得的7个分离物全基因组核苷酸序列与其它双生病毒的核苷酸序列进行了比较,可以确定G-YU-11-20、G-YU-11-26、SU-10-3-2和SU-10-19均属于甘薯卷叶病毒SPLCV;G-GUI-11-5和G-JIN-11-2与已发表的所有甘薯双生病毒之间的核苷酸序列相似性均低于89%,两者可能为双生病毒的两个疑似新种；G-JI-11-3与SPLCGV之间基因组核苷酸序列相似性大于89%,确定为SPLCGV的一个病毒株系。本研究还对SPLCV江苏分离物SPLCV-SU[3-2]的CP基因进行了克隆和表达,序列测定结果表明,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。将CP基因与载体PGEX-4T-3相连接,成功构建了原核表达载体PGEX-SPLCVCP。SDS-PAGE分析表明,含重组质粒的大肠杆菌经过IPTG诱导后可产生约54.3kDa左右的融合蛋白条带。SPLCV CP蛋白的成功表达为特异性抗体的制备奠定了基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
第一章绪论  8-24
  1.1 甘薯生产现状及用途  8
  1.2 甘薯病毒病的发生及危害  8-9
  1.3 甘薯病毒的检测方法  9-12
    1.3.1 症状诊断法  9-10
    1.3.2 生物学鉴定方法  10
    1.3.3 病毒形态鉴定法  10
    1.3.4 血清学检测  10-11
    1.3.5 分子生物学检测方法  11-12
  1.4 双生病毒研究进展  12-20
    1.4.1 双生病毒的发生和危害  12-13
    1.4.2 双生病毒的结构特征与分类  13-16
    1.4.3 双生病毒的复制与转录  16-17
    1.4.4 双生病毒的转录及表达调控  17
    1.4.5 双生病毒的变异  17-19
    1.4.6 双生病毒的检测  19-20
  1.5 与单组分Begomovirus伴随的卫星DNA分子的研究  20-22
    1.5.1 卫星DNA1分子  20
    1.5.2 卫星DANβ分子  20-21
    1.5.3 缺陷性干扰小分子DNA  21-22
  1.6 侵染甘薯的双生病毒的研究进展  22-23
  1.7 本项研究的目的和意义  23-24
第二章我国甘薯上双生病毒的分子鉴定  24-42
  2.1 材料与方法  24-30
    2.1.1 试验材料  24-25
    2.1.2 试验方法  25-30
  2.2 结果与分析  30-41
    2.2.1 甘薯上双生病毒的PCR检测以及DNA-A全序列的测定  30-32
    2.2.2 7个双生病毒分离物全基因组序列的相似性分析  32
    2.2.3 7个分离物与Gene Bank上登录的其它双生病毒之间的全基因组序列相似性对比  32-36
    2.2.4 进化关系分析  36-37
    2.2.5 基因组结构分析  37-41
    2.2.6 DNA-β组分的PCR检测  41
    2.2.7 DNAβ的PCR检测  41
  2.3 讨论  41-42
第三章甘薯卷叶病毒江苏分离物(SPLCV-SU[3-2])外壳蛋白基因的克隆以及在大肠杆菌中的表达  42-49
  3.1 材料与方法  42-44
    3.1.1 实验材料  42
    3.1.2 试验方法  42-44
  3.2 结果与分析  44-47
    3.2.1 SPLCV-SU[3-2]CP基因序列的测定以及相似性分析  44-45
    3.2.2. SPLCV-SU[3-2]CP基因原核表达载体的构建  45-46
    3.2.3 CP基因表达产物的SDS-PAGE分析  46-47
  3.3 讨论  47-49
第四章结论与讨论  49-51
  4.1 结论  49-50
  4.2 创新  50
  4.3 有待改进和继续的工作  50-51
参考文献  51-60
致谢  60-61
附录  61-63
作者简介  63

农杆菌介导hrpZ_（Psg12）基因转化大豆的研究

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