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农杆菌介导hrpZ_（Psg12）基因转化大豆的研究

作　者: 卢宝慧
导　师: 高洁
学　校: 吉林农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: xylA hrpZPsg12 载体构建 农杆菌介导法 转基因大豆
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


大豆[Glycine max(L.)Merr]是重要的油料作物和粮食作物,是植物蛋白的主要来源,在世界范围内具有无可替代的作用。但是,在大豆生产过程中,因受到大豆灰斑病、大豆疫霉根腐病、大豆花叶病毒病等病害的影响,每年的产量损失在10%-30%,直接制约着大豆产量和品质的提高。培育抗病、高产、优质的大豆新品种迫在眉睫。常规育种选育周期长、优质资源匮乏,而且基因之间存在连锁和交换现象,使得优良品种的培育进展缓慢。基因工程技术的应用,克服了远缘杂交不亲和的障碍,可以将许多优良抗病基因导入大豆并获得抗病性,为大豆抗病育种开辟了一条崭新的途径。hrp基因家族中来源于大豆细菌性斑点病菌的hrpZpsg12基因,同其它hrp基因一样,它所编码的harpin类蛋白能够引起非寄主植物的过敏性坏死反应(Hyperensensitive response, HR),进而诱发整个植株获得系统抗性(Systemic acquired resistance, SAR),从而使植物获得广谱抗病性。许多植物不能利用木糖,木糖异构酶基因(xylA)编码的木糖异构酶能够将D-木糖转变为D-木酮糖,而木酮糖能够在植物体内经磷酸戊糖途径或糖酵解途径被植物利用。xylA的编码产物对植物本身无毒害作用,因此,将xylA基因作为标记基因进行大豆遗传转化具有广阔的应用前景。利用基因工程技术,构建以xylA基因为筛选标记的含hrpZPsgl2基因的安全标记植物表达载体,采用农杆菌介导的方法将hrpZPsg12基因导入大豆,以期获得具有广谱抗病性的转基因植株。本研究主要取得如下研究结果：1.根据GenBank上xylA基因序列设计引物,以大肠杆菌top10基因组为模板进行PCR扩增,扩增产物连入克隆载体pMD18-T;设计一对特异性引物,两端分别引入Xba Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点,以pGM-hrpZPsg12质粒为模板扩增目的基因,扩增产物连入克隆载体pMD18-T; XbaⅠ/Sac Ⅰ双酶切pCAMBIA3301和pMD18-hrpZpsg12,回收目的片段,经T4DNA Ligase连接后获得植物表达载体pCAMBIA3301-hrpZPsg12;Xho Ⅰ单酶切pMD18-xylA和pCAMBIA3301-hrpZpsg12,回收目的片段,经T4DNA Ligase连接后获得安全标记植物表达载体pCAMBIA3301-xylA-hrpZpsg12.2.对大豆胚尖组织培养部分体系进行了优化。芽诱导时添加3.5mg/L6-BA、0.1mg/LIBA时诱导效果较好,生根培养时添加0.5mg/L IBA、1mg/L NAA时根诱导率可达94.41%；3.通过培养基中添加木糖与否对胚尖不定芽生长发育的影响,证实了木糖异构酶基因xylA应用于大豆的可行性。4.利用农杆菌介导法,以木糖为筛选剂,将hrpZPsg12基因导入大豆,并获得再生植株,PCR初步检测2株转化植株呈阳性。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章 文献综述  10-27
  1.1 转基因大豆概述  10-23
    1.1.1 大豆遗传转化方法  11-15
    1.1.2 大豆遗传转化中所用的受体  15-18
    1.1.3 大豆遗传转化中用到的标记基因  18-21
    1.1.4 大豆转基因面临的主要问题及对策  21-23
  1.2 大豆抗病基因工程的应用  23-24
  1.3 hrp基因及其编码的harpin类蛋白的研究进展  24-25
    1.3.1 hrp基因的发现  24
    1.3.2 hrp基因的功能  24-25
    1.3.3 Harpin类蛋白的应用  25
  1.4 本研究的目的与意义  25-27
第二章 pCAMBIA3301-xylA-hrpZ_(Psg12)植物表达载体的构建  27-45
  2.1 材料与方法  27-29
    2.1.1 构架载体及菌株  27
    2.1.2 试验中用到的试剂及药品  27-28
    2.1.3 培养基  28
    2.1.4 主要仪器及设备  28-29
  2.2 载体构建  29-39
    2.2.1 安全标记基因xylA的克隆  29-35
    2.2.2 pCAMBIA3301-hrpZ_(Psg12)植物表达载体的构建  35-39
  2.3 植物表达载体构建试验结果  39-45
    2.3.1 安全标记基因片段xylA的克隆  39-40
    2.3.2 植物表达载体pCAMBIA3301-hrpZ_(Psg12)的构建  40-43
    2.3.3 安全标记植物表达体pCAMBIA3301-xylA-hrpZ_(Psg12)的构建  43-44
    2.3.4 植物表达载体向农杆菌EHA105的转化  44-45
第三章 大豆组织培养体系的优化  45-52
  3.1 材料  45-46
    3.1.1 供试大豆品种  45
    3.1.2 供试农杆菌菌株及质粒  45
    3.1.3 基础培养基  45-46
  3.2 方法  46-48
    3.2.1 大豆成熟种子不同消毒方法效果比较  46
    3.2.2 胚尖外植体的丛生芽诱导  46-47
    3.2.3 大豆生根体系的优化  47-48
  3.3 结果与分析  48-52
    3.3.1 不同消毒处理方法比较  48-49
    3.3.2 丛生芽诱导效果分析  49-50
    3.3.3 不同处理的生根效果分析  50-51
    3.3.4 结论  51-52
第四章 hrpZ_(Psg12)基因转化大豆的研究  52-60
  4.1 材料  52
    4.1.1 供试大豆品种  52
    4.1.2 供试农杆菌菌株及质粒  52
    4.1.3 培养基  52
  4.2 试验方法  52-54
    4.2.1 pCAMBIA3301-xylA-hrpZ_(Psg12)向大豆中的转化  52-54
  4.3 转基因植株的分子检测  54
    4.3.1 转化植株基因组DNA的提取  54
    4.3.2 转化植株的PCR检测  54
  4.4 结果与分析  54-60
    4.4.1 D-木糖在大豆中应用的可行性  54-56
    4.4.2 侵染后对胚尖外植体诱导出芽的影响  56
    4.4.3 转基因植株的获得  56-58
    4.4.4 转基因植株的分子检测  58-60
第五章 结论与讨论  60-64
  5.1 结论  60-61
  5.2 讨论  61-62
    5.2.1 xylA基因的筛选效率  61
    5.2.2 大豆萌发效率  61
    5.2.3 大豆组织培养过程中的褐化问题  61-62
    5.2.4 生根前处理对再生植株根诱导的影响  62
    5.2.5 转基因大豆植株的分子检测问题  62
  5.3 后续研究工作  62-64
参考文献  64-70
致谢  70-71
作者简历  71

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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