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发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立与应用

作　者: 宗晓秋
导　师: 张东升; 彭德良
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆毛状根大豆孢囊线虫接种发根农杆菌
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

发根农杆菌通过伤口侵染植物，Ri质粒上T-DNA所携带的基因在宿主细胞中整合表达，诱导植物产生毛状根。诱导产生的毛状根保持了正常根组织的形态及功能，其具有激素自养、生长速度快、遗传稳定等特点。毛状根分之多、侧根丰富，为大豆孢囊线虫提供了大量的侵染位点，是研究大豆孢囊线虫与植物根部互作的良好材料。向大豆幼苗注射农杆菌的方法可成功诱导毛状根的产生。大豆幼苗栽种在土壤5-7d，向靠近子叶及初生根的幼苗胚轴注射农杆菌的单菌落，密闭、高湿环境下诱导产生毛状根，GUS染色检测转化的毛状根。实验结果表明：中黄13、自贡冬豆、黑豆51三个品种大豆经诱导均能产生无分支的毛状根，三者毛状根的数量没有显著差异（p＞0.05）。注射农杆菌的浓度及注射位点的位置都会影响幼苗产生毛状根的数量和毛状根转化率：注射农杆菌单菌落诱导产生毛状根的数量和转化率都显著高于注射菌液产生毛状根的数量和转化率（p＜0.05）；靠近初生根胚轴产生毛状根数量显著高于靠近子叶节产生毛状根的数量，但前者的转化率却显著低于子叶节胚轴毛状根的转化率。大豆幼苗栽种在培养基中，向靠近初生根的幼苗胚轴注射农杆菌的单菌落，经过诱导、除菌培养基的培养，最终将幼苗移至含卡那霉素100mg/L的1/2MS固体培养基筛选转化的毛状根。结果证实：土壤介质诱导产生的毛状根数量与培养基介质诱导产生的毛状根数量差异显著（p＜0.05）。外植体浸泡在农杆菌菌液中诱导产生毛状根：大豆种子萌发采用水琼脂培养基，留有子叶节的子叶作为外植体浸泡在A600OD为0.6的农杆菌菌液中15min，外植体转移至1/10MS固体培养基+0.02g/L乙酰丁香酮培养基黑暗培养3～5d，1/2MS液体培养基清洗外植体并置于1/2MS+羧苄青霉素钠（250mg/L）+头孢霉素（250mg/L）除菌培养基，除菌彻底后将外植体转移至1/2MS固体培养基，25℃、12h/d光照条件诱导产生毛状根。切取转化毛状根的根尖于1/2MS液体培养基继代培养，用于线虫接种。子叶节处长出的毛状根主根不明显，侧根丰富，呈负向地性。黑豆44经诱导产生的毛状根数量最多，显著多于中黄13和黑豆51；并且黑豆44毛状根转化率显著高于中黄13，但与黑豆51毛状根转化率没有显著差异。光照或黑暗培养对中黄13产生毛状根的效率没有显著影响，但黑豆44与黑豆51在黑暗培养条件下子叶产生的毛状根数明显高于光照培养条件下产生的毛状根数。转化毛状根及其继代培养根系在GUS染色检测中呈阳性，PCR反应也检测到转化毛状根及继代培养根系中的标记基因（GFP基因）。证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA已经整合到大豆细胞的基因组。浸泡法和注射法均可高效地诱导大豆中黄13、黑豆44、黑豆51、自贡冬豆产生毛状根，不同大豆品种毛状根数量及转化率差异明显。大豆孢囊线虫（4号小种）接种毛状根条件的优化：0.1%氯化汞+0.5%的洗必肽溶液对线虫表面进行消毒，线虫的接种密度为500头/mL，接种培养基琼脂浓度为0.8%时，线虫的侵染效率最高。计算线虫侵染率结果表明：接种密度过大（2000头/mL），线虫个体间竞争激烈，降低了侵染效率。液体培养基中，线虫几乎不侵染毛状根；接种培养基琼脂浓度为1.0%、1.2%、1.4%、1.6%时，线虫的侵染效率没有显著差异。大豆孢囊线虫能够侵染三个品种大豆毛状根，2龄幼虫进入到植物根系后向维管束移动，最终聚集在维管束周围。毛状根中观察到成熟雌虫，说明大豆孢囊线虫在毛状根中能完成发育过程。孢囊线虫2龄幼虫对黑豆51的侵染效率显著高于黑豆44和中黄13。本研究建立的大豆发根体系为大豆孢囊线虫致病相关基因功能验证及致病机制研究的转化提供了重要技术基础，对探索大豆孢囊线虫致病机制及抗线虫大豆品种选育具有重要的意义。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章引言  14-23
  1.1 大豆孢囊线虫病的研究进展  14-17
    1.1.1 大豆孢囊线虫病的分布及经济重要性  14-15
    1.1.2 大豆孢囊线虫病的症状  15
    1.1.3 大豆孢囊线虫病病原及生物学特性  15-16
    1.1.4 大豆孢囊线虫病与环境关系  16-17
    1.1.5 防治  17
  1.2 大豆遗传转化的研究进展  17-18
    1.2.1 大豆转化的发生途径  17-18
    1.2.2 大豆遗传转化的方法  18
  1.3 发根农杆菌的研究进展  18-21
    1.3.1 发根农杆菌及 Ri 质粒  18-19
    1.3.2 毛状根的特性  19-20
    1.3.3 毛状根的转化与鉴定  20-21
  1.4 毛状根在研究植物与寄生线虫互作关系上的应用  21-22
  1.5 本实验的研究目的和意义  22-23
    1.5.1 目的  22
    1.5.2 意义  22-23
第二章浸泡法诱导大豆毛状根  23-54
  2.1 材料与方法  23-31
    2.1.1 供试材料  23
    2.1.2 主要试剂及酶类  23
    2.1.3 主要仪器  23
    2.1.4 培养基  23-25
    2.1.5 菌株的活化和菌液的制备  25-26
    2.1.6 大豆种子的消毒及外植体的获得  26-27
    2.1.7 大豆毛状根的诱导  27
    2.1.8 大豆毛状根的检测  27-30
    2.1.9 毛状根的继代培养  30-31
    2.1.10 大豆孢囊线虫侵染大豆毛状根  31
    2.1.11 数据分析  31
  2.2 结果与分析  31-50
    2.2.1 大豆种子萌发培养基的选择  31-33
    2.2.2 外植体的选择  33-34
    2.2.3 农杆菌侵染条件的优化  34
    2.2.4 农杆菌侵染条件的优化  34-38
    2.2.5 共培养光照条件对诱导毛状根及转化率的影响  38
    2.2.6 除菌条件的优化  38-40
    2.2.7 大豆毛状根的形态  40
    2.2.8 转化毛状根检测结果  40-41
    2.2.9 不同品种大豆产生毛状根的数量及转化效率  41-42
    2.2.10 状根继代培养体系的优化  42-45
    2.2.11 线虫接种毛状根的优化  45-50
  2.3 小结与讨论  50-54
第三章穿刺法诱导毛状根  54-65
  3.1 材料和方法  54-55
    3.1.1 供试材料  54
    3.1.2 主要试剂  54
    3.1.3 培养基  54
    3.1.4 发根农杆菌菌株的活化和菌液的制备  54-55
    3.1.5 土壤介质中毛状根的诱导  55
    3.1.6 培养基介质中毛状根的诱导  55
    3.1.7 转化毛状根的检测  55
  3.2 结果与分析  55-63
    3.2.1 土壤介质中毛状根的获得及影响因素  55-59
    3.2.2 培养基介质中毛状根的获得  59-61
    3.2.3 不同介质诱导毛状根的数量及转化率差异  61
    3.2.4 不同方法诱导大豆产生毛状根的比较  61-63
  3.3 小结与讨论  63-65
第四章全文结论  65-67
参考文献  67-75
致谢  75-76
作者简介  76

发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立与应用

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