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紫花苜蓿再生体系及遗传转化的研究

作　者: 薛晓锋
导　师: 周岩
学　校: 河南科技学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 紫花苜蓿再生体系 SeNHX1基因根癌农杆菌超声波遗传转化
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种多年生优质豆科牧草,不仅营养价值丰富,而且适应强,素有“牧草之王”之美誉。它具有发达的根系、根瘤,能够有效的固氮、保持水土、改良土壤、肥田增产。长期以来,紫花苜蓿生长在低盐或非盐渍化土壤中,其抗盐能力较弱,属于中等抗盐作物,在盐碱地上较难生长。现代生物学技术的迅速发展,为进一步开展紫花苜蓿耐盐转基因育种提供新方法。本研究以阿尔冈金、爱菲尼特、牧歌、三得利、维多利亚、金皇后6个紫花苜蓿栽培品种为研究对象,通过愈伤组织的诱导及不定芽的分化,建立紫花苜蓿再生体系；利用超声波辅助的农杆菌介导法将SeNHXl盐角草逆向转运蛋白基因导入紫花苜蓿,建立高效的紫花苜蓿遗传转化体系。主要研究结果如下：1.高效紫花苜蓿再生体系的建立(1)以上述6个栽培品种的子叶、下胚轴、叶片为外植体,在MS+2mg／L2,4-D+0.2mg／L KT进行愈伤组织的诱导。结果表明：下胚轴的出愈率最高,子叶次之,叶片的出愈率最低。6个栽培品种中爱菲尼特和阿尔冈金下胚轴出愈率为100%,三得利出愈率最低,为88.56%,维多利亚、金皇后、牧歌出愈率依次为96.80%、93.45%、90.46%。(2)由(1)子叶和下胚轴形成的愈伤组织,转移至分化培养基Rhc、Rhd、Rhe。实验结果表明：来自于子叶的愈伤组织不定芽分化率明显高于下胚轴；愈伤组织在MS+1mg／L6-BA+0.3mg／L NAA上的不定芽分化率最高。(3)单一2,4-D浓度及2,4-D与KT配合作用下,对紫花苜蓿愈伤组织形成及不定芽分化的诱导,结果显示：单一2,4-D条件下,2mg／L有利于6个栽培品种形成愈伤组织；2,4-D与KT配合使用,紫花苜蓿出愈率要高与单独使用2,4-D的出愈率；牧歌在2mg／L2,4-D和0.2mg／L KT作用下,出愈率最高,而其他几个品种出愈率在2mg／L2,4-D和0.25mg／L KT作用下最高。紫花苜蓿在2mg／L2,4-D和0.25mg／L或0.5mg／L KT上形成愈伤组织有利于不定芽的分化。(4)6个栽培品种子叶在愈伤组织诱导培养基(MSH1)上分别培养7d、10d、15d、20d、60d后,转移至分化培养基(Rhd)进行继续培养。结果显示：三得利需经MSH1诱导15d后,愈伤组织不定芽分化率最高；爱菲尼特、阿尔冈金、维多利亚、金皇后经MSH1诱导20d左右的不定芽发生率最高：而牧歌经MSH1诱导60d后可获得最高的不定芽发生率。2.愈伤组织的细胞学观察对爱菲尼特子叶愈伤组织进行扫描电镜观察,结果显示：构成胚性细胞的团粒结构,细胞体积大,形状为圆形或椭圆形,容易分离；而非胚性愈伤组织或质地坚硬或水浸状,细胞多成类似纤维状的长扁形细胞,各个细胞接合紧密,难以分开。3.超声波辅助农杆菌介导苜蓿基因转化体系的建立以建立的紫花苜蓿高频再生体系为基础,利用超声波辅助农杆菌介导将携带逆向转录蛋白基因SeNHX1的pBin121双元载体导入紫花苜蓿子叶中,研究影响遗传转化的若干因素,获得了抗性愈伤组织。结果显示：子叶在侵染之前超声波处理10mmin,菌液浓度OD600为0.5左右,侵染10min,其抗性愈伤组织发生率最高；脱菌培养时,头孢霉素为300mg／L时,既能有效抑制农杆菌生长,又对植物材料伤害较小；阿尔冈金等5个品种均以50mg／L的卡那霉素为选择压,而维多利亚以40mg/L的浓度来筛选抗性愈伤组织。对爱菲尼特、阿尔冈金、牧歌、金皇后、三得利、维多利亚卡那霉素抗性愈伤组织,进行SeNHX1基因的PCR分子检测,其结果均为阳性。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
目录  9-13
缩略词中英文对照表  13-14
第一章文献综述  14-28
  1.1 紫花苜蓿再生途径  15-16
  1.2 影响紫花苜蓿再生体系建立的因素  16-19
    1.2.1 外植体的选择  16-17
    1.2.2 外源激素  17
    1.2.3 基因型  17-18
    1.2.4 培养基  18
    1.2.5 添加物的使用  18-19
  1.3 苜蓿体细胞超微结构研究  19-20
  1.4 苜蓿转基因技术  20-23
    1.4.1 根癌农杆菌介导的基因转移  20-21
    1.4.2 基因枪法  21-22
    1.4.3 花粉管通道法  22
    1.4.4 其他方法  22-23
  1.5 支付耐盐基因及研究进展  23-26
    1.5.1 植物耐盐基因  23-24
    1.5.2 Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SeNHX1转基因研究  24-25
    1.5.3 耐盐转基因苜蓿  25-26
  1.6 本课题研究目标及研究内容  26-28
第二章六个紫花苜蓿栽培品种再生体系的建立  28-42
  2.1 材料和方法  28-29
    2.1.1 植物材料  28
    2.1.2 植物激素  28
    2.1.3 培养基  28-29
    2.1.4 主要设备  29
  2.2 实验方法  29-31
    2.2.1 紫花苜蓿无菌苗的培养  29-30
    2.2.2 不同类型外植体愈伤组织的诱导  30
    2.2.3 不同类型外植体愈伤组织的分化培养  30
    2.2.4 子叶愈伤组织诱导过程中2,4-D及2,4-D与KT的确定  30
    2.2.5 植物激素在子叶愈伤组织分化中的作用  30
    2.2.6 愈伤组织诱导时间对不定芽分化的影响  30
    2.2.7 紫花苜蓿再生植株的获得  30-31
    2.2.8 数据统计与分析  31
    2.2.9 紫花苜蓿组织形态学观察  31
  2.3 结果与分析  31-38
    2.3.1 不同外植体愈伤组织的诱导  31-32
    2.3.2 不同部位外植体愈伤组织不定芽的分化  32
    2.3.3 不同2,4-D与KT组合对紫花苜蓿愈伤组织诱导的影响  32-34
    2.3.4 不同2,4-D与KT组合对紫花苜蓿愈伤组织不定芽的分化  34-36
    2.3.5 愈伤组织诱导时间对紫花苜蓿不定芽分化的影响  36-37
    2.3.6 外植体诱导形成愈伤组织过程的形态分析  37-38
    2.3.7 紫花苜蓿愈伤组织电镜观察  38
  2.4 讨论  38-42
    2.4.1 紫花苜蓿6个栽培品种再生能力的比较  38-39
    2.4.2 不同外植体的选择对紫花苜蓿再生的影响  39
    2.4.3 植物外源激素对紫花苜蓿组织培养的影响  39-41
    2.4.4 紫花苜蓿组织培养形态学观察  41-42
第三章农杆菌介导SeNHX1基因转化紫花苜蓿的研究  42-62
  3.1 材料和方法  42-44
    3.1.1 植物材料  42
    3.1.2 大肠杆菌和农杆菌工程菌及质粒  42-43
    3.1.3 主要试剂  43
    3.1.4 培养基  43-44
    3.1.5 主要仪器设备  44
  3.2 方法  44-48
    3.2.1 载体pB1121-SeNHX1的检测  44-45
    3.2.2 农杆菌介导紫花苜蓿子叶遗传转化方法  45-46
    3.2.3 头孢霉素抑菌素浓度的选择  46
    3.2.4 选择培养基中卡那霉素选择压的确定  46
    3.2.5 根癌农杆菌适宜侵染浓度和侵染时间的确定  46
    3.2.6 超声波处理——根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化  46-47
    3.2.7 转化体的分子生物学检测  47-48
  3.3 结果与分析  48-58
    3.3.1 载体pBl121-SeNHX1鉴定结果分析  48-52
    3.3.3 头孢霉素抑菌浓度的确定  52
    3.3.4 卡那霉素选择压的确立  52-54
    3.3.5 根癌农杆菌侵染浓度及侵染时间对转化的影响  54-55
    3.3.6 超声波处理对转化效率的影响  55-56
    3.3.7 部分抗生愈伤组织PCR检测  56-58
  3.4 讨论  58-62
    3.4.1 抗生素在紫花苜蓿遗传转化中作用及其影响  58-59
    3.4.2 菌液浓度及侵染时间的选择对转化的影响  59-60
    3.4.3 超声波处理有利于提高农杆菌介导法转化效率  60-62
第四章结论与讨论  62-66
  4.1 紫花苜蓿高效再生体系的建立  62
  4.2 根癌农杆菌介导的紫花苜蓿子叶遗传转化的研究  62-63
  4.3 超声波辅助根癌农杆菌介导法  63
  4.4 部分卡那霉素抗生愈伤组织的PCR检测  63
  4.5 本研究的创新点  63
  4.6 下一步研究工作的设想  63-66
参考文献  66-72
附录  72-74
附图A  74-76
附图B  76-78
致谢  78-80
攻读学位期间发表的学术论文  80

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