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抗条绣病的小麦G蛋白基因TaRab7和TaTypA的功能研究

作　者: 刘富荣
导　师: 康振生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 小麦条锈菌 TaRab7 TaTypA 胁迫病毒诱导的基因沉默
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

由条形柄锈菌（Puccinia striiformis f.sp. tritici)侵染小麦而导致的小麦条锈病是一种十分重要的气传性真菌病害，在世界范围内对小麦的生产造成了严重的威胁。实践证明，选育种植抗病品种是防治小麦条锈病的一种经济又安全的措施。因此，研究小麦中参与抗条锈病菌的相关基因，对于阐明二者互作的分子机制，以及为小麦抗条锈病品种选育和遗传改良具有重要的理论指导意义。植物G蛋白(GTP结合蛋白)作为一种信号蛋白，直接或间接的参与细胞形态建成，细胞极性的形成，细胞凋亡，活性氧产生，细胞分化和激素反应等多种生命活动的调节作用。植物G蛋白是普遍存在于真核生物细胞中的一个GTP结合蛋白家族，根据其亚基组成及分子量大小，可将参与细胞信号转导的G蛋白分为异三聚体G蛋白、小G蛋白以及几种特殊的GTP结合蛋白。本研究在实验室已构建的小麦与条锈菌非亲和互作的cDNA文库的基础上，鉴定并克隆获得了1个小分子GTP结合蛋白基因TaRab7，及1个酪氨酸磷酸化蛋白A型G蛋白基因TaTypA。明确了这两个基因在生物胁迫和非生物的转录表达特征，最后利用病毒诱导的基因沉默技术进行了功能分析，基本明确它们在抗条锈病中的作用，获得的主要结果如下：在小麦与条锈菌互作中，TaRab7基因受条锈菌诱导高水平表达，非亲和组合表达量明显高于亲和组合；在干旱、盐胁迫以及低温胁迫的处理下，该基因表达量有明显的上调趋势。推测TaRab7基因可能参与了小麦对干旱、盐胁迫以及冷胁迫的抗逆反应。实时荧光定量PCR结果显示，TaTypA基因在亲和组合中的表达趋势比较稳定，非亲合组合中的表达趋势在24h以前有下调趋势，24h以后表达量有上调趋势。TypA型G蛋白在植物体中作为活性氧胁迫的调节基因，认为TaTypA可能通过控制活性氧积累，参与到小麦与条锈菌互作的抗病过程中。利用BSMV介导的基因沉默方法，对两个基因在小麦抗锈病过程中的功能进行初步析。成功构建了TaRab7、TaTypA基因的重组病毒载体，并且使基因在小麦中发生了有效的沉默。基因被沉默后，小麦植株的反应型发生明显变化，在接种部位产生少量的条锈菌孢子堆，并且通过显微镜观察发现，条锈菌在小麦叶片组织间隙的扩展能力增强。这说明，基因的沉默很可能使小麦对条锈菌CYR23的抗性减弱。推测基因可能参小麦与条锈菌互作反应，并对小麦抗条锈病起到一定程度的调控作用。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-21
  1.1 小麦条锈病  11-13
    1.1.1 小麦条锈病的危害  11
    1.1.2 条锈菌与小麦互作的研究现状  11-13
  1.2 植物中 G 蛋白  13-18
    1.2.1 植物中的异三聚体 G 蛋白  13-14
    1.2.2 G 蛋白 TypA/BipA 的研究进展  14
    1.2.3 小 G 蛋白的种类及功能  14-15
    1.2.4 小Ｇ蛋白在植物抗病抗逆过程中的作用  15
    1.2.5 RabGTPase 的结构及调节机制  15-16
    1.2.6 小 G 蛋白 Rab7  16-18
  1.3 溶酶体的功能  18
  1.4 生物信息学  18-19
  1.5 病毒诱导的基因沉默  19-20
  1.6 实验目的及意义  20
  1.7 实验技术路线  20-21
第二章小麦小 G 蛋白 TARAB7 基因的克隆及功能研究  21-41
  2.1 材料﹑试剂及仪器  21
    2.1.1 供试菌种和小麦品种  21
    2.1.2 试剂  21
    2.1.3 仪器  21
  2.2 实验方法  21-30
    2.2.1 培养、处理  21-22
    2.2.2 样品采集  22
    2.2.3 条锈菌侵染过程的观察  22
    2.2.4 总 RNA 的提取及 mRNA 纯化  22-23
    2.2.5 总 RNA 中去除基因组 DNA  23
    2.2.6 cDNA 合成及纯化  23-24
    2.2.7 小麦基因 TaRab7 的全长克隆  24
    2.2.8 回收 PCR 产物  24
    2.2.9 回收产物与载体的连接  24-25
    2.2.10 转化及阳性克隆的筛选  25
    2.2.11 质粒提取  25-26
    2.2.12 PCR 产物测序  26
    2.2.13 氨基酸的多序列比对及进化树分析  26
    2.2.14 TaRab7 在生物及非生物胁迫下的表达谱分析  26
    2.2.15 TaRab7 的亚细胞定位  26-28
    2.2.16 TaRab7 病毒诱导的基因沉默（VIGS）分析  28-30
  2.3 实验结果分析  30-39
    2.3.1 TaRab7 基因全长的克隆  30
    2.3.2 序列的验证  30-31
    2.3.3 氨基酸序列多重比对分析  31-32
    2.3.4 进化树分析  32-33
    2.3.5 表达谱分析  33-35
    2.3.6 亚细胞定位  35
    2.3.7 VIGS 对 TaRab7 基因的功能初步验证  35-39
  2.4 讨论  39-41
第三章 TATYPA 的 CDNA 全长克隆及功能初步分析  41-51
  3.1 实验材料  41
  3.2 实验方法  41
    3.2.1 总 RNA 的分离和 cDNA 的合成  41
    3.2.2 基因克隆  41
    3.2.3 生物信息学分析  41
    3.2.4 表达谱分析  41
    3.2.5 病毒诱导的基因沉默  41
  3.3 实验结果  41-49
    3.3.1 基因克隆  41
    3.3.2 生物信息学分析  41-45
    3.3.3 表达谱分析  45-48
    3.3.4 病毒诱导的基因沉默  48-49
  3.4 讨论  49-51
第四章结论  51-52
参考文献  52-57
附录  57-63
致谢  63-64
作者简介  64

抗条绣病的小麦G蛋白基因TaRab7和TaTypA的功能研究

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