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水稻ONAC家族基因重叠表达特性及其在抗病抗逆中的功能研究

作　者: 孙利军
导　师: 宋凤鸣
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻 NAC转录因子水稻基因芯片数据库生物和非生物胁迫 VIGS 稻瘟病白叶枯病转基因水稻
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物在生长发育的过程中,经常会受到干旱、高盐、低温、病原菌等各种非生物和生物胁迫的影响。这些胁迫通常会造成植物细胞的损伤,进而严重影响植物的生长发育和作物产量。在长期的进化过程中,植物形成了一系列生理、生化、代谢及防御机制,以适应和抵御各种生物和非生物逆境。在众多的适应和抗逆机制中,基因表达的转录调控在植物适应环境和抵御逆境胁迫中起重要作用。NAC (NAM/ATAF/CUC)家族基因是植物特有的一类转录因子,存在于多种植物中,其共同特点是在N端含有一段高度保守、约由150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。研究表明,NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控、而且在植物抗病抗逆反应中具有重要的调控作用。本研究系统分析了ONAC家族基因对生物与非生物胁迫的响应、并分离克隆21个抗病抗逆相关的(?)NAC基因。在此基础上,研究了这21个ONAC基因在抗病信号分子处理、水稻-稻瘟菌和水稻-白叶枯病菌互作中的表达模式,以及初步分析了部分基因的生化特性和在抗病抗逆中的功能,旨在发现潜在的抗病抗逆胁迫相关的基因,为基因工程提高水稻抗病抗逆性能提供理论基础。本研究的主要内容及结果如下：本研究利用水稻基因芯片公共数据库[Rice Oligonucleotide Array Database (ROAD)(http://www.ricearray.org/)],对多种生物[稻瘟病(Magnaporthe grisea)、寄生植物独脚金(Striga hermonthica)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)、水稻白叶枯病((?)(anthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)]与非生物(高盐、干旱、低温)胁迫下ONAC家族基因的响应进行分析,并选择30个ONAC基因对部分胁迫因子下的响应进行验证,结果发现该家族基因有63个ONAC基因对多种胁迫因子有重叠表达的特性,在这些重叠表达的基因中,多数基因在高盐、干旱、低温、稻瘟病、寄生植物独脚金、水稻条纹病毒诱导上调表达。对于非生物胁迫,38个ONAC基因重叠表达于任意两种胁迫条件,且选择的30个ONAC基因中有16个受脱落酸(Abscisic acid、ABA)诱导表达；而对于生物胁迫,有65个基因重叠表达于任意两种生物肋迫因子。系统进化树分析表明这些重叠表达的基因分布于ONAC家族的10个亚组[OsNAC7(SND)、ONAC11(NAC1)、 SNACⅠ、SNACⅡ (NAM/CUC3)、SNACⅢ(TIP)、SNACⅣ (ANAC34)、ONAC079(ONAC6、ONAC012(ONAC7)、ONAC135(0NAC3)和ONAC100(ONAC2)],同源搜索发现在该家族有16组基因高度同源。ONAC基因对多种胁迫因子的重叠表达特性及其基因间的高度同源性,预示着ONAC基因的功能多效性和相似性。选择克隆了21个水稻抗病抗逆相关候选ONAC基因,研究了这些ONAC基因在抗病信号分子处理、水稻-稻瘟菌以及水稻-白叶枯病菌互作中的表达模式。结果表明分离获得的21个抗病抗逆相关ONAC基因中,除了ONAC058和(ONAC066,多数ONAC基因的表达能被水杨酸(Salicylic acid, SA)、茉莉酸(Jasmonic acid, JA)、 ACC (Ethylene, ET)多个抗病信号分子所诱导,但表达模式在不同抗病信号分子处理后不尽相同,相对于SA,多数ONAC基因对ACC (ET)或JA的响应程度较强。其中,12个ONAC基因(OsNAC8、ONAC016、ONAC022、ONAC023、ONAC049、 ONAC054、ONAC061、ONAC063、ONAC075、ONAC095、ONAC122和(ONAC131)的表达可以被ACC (ET)强烈诱导,6个ONAC基因(SNAC1、OsNAC4、OsNAC5、 OsNAC6、ONAC103和ONAC121)表达受JA强烈诱导,这些结果表明这18个抗病抗逆相关ONAC基因是通过JA/ET信号途径或通过JA/ET与SA信号途径参与水稻的抗病反应。在水稻-稻瘟菌、水稻-白叶枯病菌互作模式下,11个ONAC (ONAC022、ONAC023、ONAC049、ONAC054、ONAC061、ONAC075、ONAC095、 ONAC103、ONAC121、ONAC122和ONAC131)基因在水稻-稻瘟病菌、水稻-白叶枯病菌的非亲和性互作中特异性地诱导表达,因而可能与水稻抗稻瘟病、水稻白叶枯病反应的激活有关。此外,3个ONAC基因(OsNAC6、OsNAC8、ONAC063)在水稻-稻瘟病菌的非亲和性互作中特异性地诱导表达,而在水稻-白叶枯病菌的非亲和性互作中表达下调,这3个基因可能与抗水稻稻瘟病激活有关,且与抗水稻白叶枯病的抑制有关。4个ONAC基因(OsNAC3、OsNAC4、ONAC016和ONAC058)在水稻-白叶枯病菌非亲和性互作中上调表达,可能参与水稻对白叶枯抗病的激活有关。选择研究5个ONAC基因(ONAC023、ONAC063、ONAC095、ONAc122、 ONAC131)的亚细胞定位和转录活性,发现这5个基因编码的蛋白都能定位于细胞核,且都具有转录激活活性。采用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)初步对一些分离的ONAC基因的抗病功能进行初步的研究。结果发现当5个ONAC基因(ONAC023、ONAC095、ONAC122、 ONAC131(?)口(OsNAC6)分别沉默后,水稻抗稻瘟病害表现出感病性的增加,且一些抗病相关的基因(Oseds1、OsPAD4、OsLOX、OsPR3、OsPR1a、OsWRKY45、OsJamyb和(?)OsNH1/NPR1)也不同程度的表达下调,表明这5个ONAC基因通过直接或间接调控这些抗病相关的基因参与水稻对稻瘟病抗性。另外,ONAC023和ONAC095两个基因沉默后,对白叶枯病的抗病性下降,表明这两个基因可能在白叶枯抗病中具有正向调控的作用。为了深入的探讨ONAC基因在抗病抗逆反应中的功能,构建了多数克隆的ONAC基因的超表达载体和SRDX载体,并导入水稻秀水11品种中。目前已经获得一些基因的超表达转基因株系或SRDX转基因株系,正在通过分子生物学方法对转基因株系进行鉴定,其中ONAC075-oe、OsNAC6-oe转基因株系的T0代种子已获得,并对其在抗病抗逆中的功能进行初步分析。结果表明过量表达OsNAC6和ONAC075的水稻转基因株系,对稻瘟病抗性和干旱胁迫的耐受性增加,而这2个基因参与植物抗病、抗逆的机制还需进一步的研究。

全文目录

致谢  6-8
目录  8-10
摘要  10-13
Abstract  13-16
第一章文献综述和研究背景  16-30
  1.1 NAC转录因子的特征  16-19
    1.1.1 结构特征  16-17
    1.1.2 家族特征  17-19
  1.2 NAC转录因子在植物抗非生物逆境胁迫中的作用  19-22
    1.2.1 NAC基因表达对非生物逆境的响应  19-20
    1.2.2 NAC转录因子在干旱和高盐逆境胁迫反应中的作用  20-22
    1.2.3 NAC转录因子在其它非生物逆境中的作用  22
  1.3 NAC转录因子在抗病反应中的作用  22-26
    1.3.1 NAC基因表达对病菌侵染的响应  22-23
    1.3.2 在活体寄生真菌病害抗性中的作用  23-24
    1.3.3 在抗坏死性真菌病害中性中的作用  24
    1.3.4 在过敏性反应中的作用  24-26
  1.4 NAC转录因子活性的调控机制  26-27
    1.4.1 MIRNA对NAC基因表达的调控  26
    1.4.2 NAC转录因子蛋白水平上的调控  26-27
  1.5 小结与展望  27-28
  1.6 本研究的目的意义、主要研究内容  28-30
第二章 ONAC家族基因对非生物和生物胁迫响应重叠表达的特性研究  30-48
  2.1 材料与方法  30-34
    2.1.1 基因芯片数据分析  30-31
    2.1.2 植物材料和处理  31
    2.1.3 水稻总RNA的提取  31-32
    2.1.4 CDNA的合成  32
    2.1.5 实时定量PCR  32-34
    2.1.6 序列分析  34
  2.2 结果  34-45
    2.2.1 ONAC基因对非生物胁迫响应的重叠表达特性  34-37
    2.2.2 ONAC基因对生物胁迫响应的重叠性表达特性  37-41
    2.2.3 ONAC基因对生物与非生物胁迫响应的重叠性表达特性及其进化关系分析  41-45
  2.3 讨论  45-48
第三章抗病抗逆相关ONAC基因克隆和表达及生化特性研究  48-72
  3.1 材料与方法  48-54
    3.1.1 水稻幼苗培育  48
    3.1.2 ONAC基因的克隆  48-50
    3.1.3 克隆ONAC基因的序列分析  50
    3.1.4 抗病相关的激素处理  50
    3.1.5 水稻-稻瘟菌互作处理  50-51
    3.1.6 水稻-白叶枯病菌互作处理  51
    3.1.7 RNA 提取、cDNA 合成、实时定量 PCR  51
    3.1.8 基因亚细胞定位分析  51-52
    3.1.9 ONAC基因转录活性分析  52-54
  3.2 结果  54-67
    3.2.1 ONAC基因的克隆与鉴定  54
    3.2.2 ONAC基因的序列分析  54-57
    3.2.3 抗病信号分子处理后克隆的ONAC基因的表达模式研究  57-59
    3.2.4 水稻-稻瘟菌互作下克隆的ONAC基因的表达模式研究  59-61
    3.2.5 水稻-白叶枯病菌互作下克隆的ONAC基因的表达模式研究  61-63
    3.2.6 亚细胞定位  63-65
    3.2.7 转录激活活性  65-67
  3.3 讨论  67-72
    3.3.1 ONAC基因的分离与序列分析  67
    3.3.2 分离ONAC基因通过不同的信号传导途径参与水稻诱导抗病反应  67-69
    3.3.3 分离的ONAC基因参与水稻对稻瘟病或白叶枯病的抗性  69-70
    3.3.4 ONAC转录因子的生化特性  70-72
第四章部分ONAC基因在抗病反应中的功能分析  72-100
  4.1 材料与方法  72-80
    4.1.1 VIGS载体的构建  72-73
    4.1.2 水稻幼苗培育及VIGS侵染  73-74
      浸染菌液的准备  73
      侵染条件  73-74
    4.1.3 基因沉默植株的鉴定及抗病相关基因的检测  74
    4.1.4 水稻转基因表达载体PCOU-ONAC-OE和PCOU-ONAC-SRDX的构建  74-78
    4.1.5 转基因水稻的遗传转化  78
    4.1.6 水稻基因组的提取和转基因水稻株系的分子鉴定  78-79
    4.1.7 水稻稻瘟病病害分析  79
    4.1.8 水稻白叶枯病害分析  79-80
  4.2 结果  80-96
    4.2.1 5个ONAC基因沉默后水稻对稻瘟病感病性增加  80-85
    4.2.2 ONAC023和ONAC095沉默后水稻对白叶枯感病性增强  85-87
    4.2.3 5个ONAC基因沉默后一些抗病相关基因的表达下调  87-90
    4.2.4 转基因载体的构建  90-91
    4.2.5 水稻转基因苗的鉴定  91-93
    4.2.6 水稻转基因幼苗在抗稻瘟病中功能初步的分析  93-95
    4.2.7 水稻转基因幼苗在干旱胁迫中功能初步的分析  95-96
  4.3 讨论  96-100
    4.3.1 5个ONAC基因正向调控水稻对稻瘟病或白叶枯病的抗病反应  96-99
    4.3.2 过量表达OSNAC6和ONAC075增强水稻对稻瘟菌的抗性和干旱的耐受性  99-100
第五章全文小结和今后研究  100-104
参考文献  104-115

水稻ONAC家族基因重叠表达特性及其在抗病抗逆中的功能研究

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