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不同白僵菌菌株的生物学特性比较及HFW-05菌株田间种群动态

作　者: 魏灵燕
导　师: 朱宝成; 冯书亮
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 球孢白僵菌 生物学特性 酯酶同工酶 RAPD 种群动态
分类号: S476.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是目前国内外应用最广泛的昆虫病原真菌之一,可侵染15个目149个科的700多种昆虫。本研究以在不同寄主中分离纯化得到的15株球孢白僵菌为供试菌株,明确了15株供试菌株的生物学特性、孢子萌发特性、种间分类和酯酶型特征;通过RAPD方法比较研究了15株菌的分子遗传差异性;并研究了白僵菌HFW-05菌株在田间土壤的宿存能力,及其在田间作物番茄、黄瓜和洋白菜的叶片表面和叶肉中的定殖情况,及其对原始微生物细菌、放线菌种群的影响。为了明确不同白僵菌菌株的生物学特征和其属间地位,对15株白僵菌菌株的ITS片段进行测序分析,并对这些菌株的菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率、单芽管孢子萌发比例、单芽管平均长度和长芽管平均长度等多项生物学指标进行测定。序列分析表明它们均为球孢白僵菌,各菌株的菌落生长速率无显著差异;单芽管孢子萌发比例变化范围11.91-96.03%;单芽管平均长度和双芽管平均长度分别为6.28-21.43μm和10.338-19.902μm;各菌株间孢子萌发率差异很大,变化范围22.09%-86.32%。对菌株的培养特性(孢子萌发率、产孢量和菌落生长速率)与孢子萌发特性(单芽管孢子萌发比例、芽管总平均长度和芽管整齐度)这两个主因子进行典型相关分析,两性状集团总体相关不显著(p=0.341),而孢子萌发率与单芽管孢子萌发比例相关显著,菌落生长速率与芽管总平均长度呈显著差异。为了研究15株白僵菌的遗传多态性,利用酯酶同工酶酶谱和RAPD技术对这这些菌株的遗传多样性进行了研究。酯酶同工酶结果表明,15株菌为球孢白僵菌种下的不同酯酶型,菌株间的相似性在在0.125-1.000之间,在相似性系数0.7位置上可以分为10个组群。利用RAPD-PCR技术,从160个RAPD引物中筛选出多态性高、条带清晰的47个引物,共得到497条RAPD条带,片段大小在100bp-2200bp之间,其中多态性条带数为416,多态性为83.70%,菌株间的相似度范围在0.4848-0.8848之间,在相似性系数0.7位置上可以分为6个组群,从相似性聚类图上,菌株的遗传多样性与寄主来源未表现出相关性,而其与地理来源的相关性也没有很明确的表现出来。这一结论与酯酶同工酶酶谱相同。为了研究HFW-05菌株在田间植株和土壤中的宿存状态,分别采用叶面喷菌和灌根方法对HFW-05在田间的宿存状态进行测定。结果表明,HFW-05在番茄叶片表面和叶肉中均可以定殖,最终定殖量分别为29.25±6.50×105 cfu/g鲜叶和9.2±1.06×103 cfu/g鲜叶,洋白菜叶片上分别为21.45±2.30×105 cfu/g鲜叶和5.94±1.15×103 cfu/g鲜叶。在土壤定殖研究中,HFW-05在灭菌土的最终定殖量为53.10±5.16×106 cfu/g土,非灭菌土为28.04±5.34×106 cfu/g土,其在灭菌土中的定殖能力高于非灭菌土,且发现白僵菌有利于土壤中细菌放线菌微生物种群的生存和繁殖。结果表明,球孢白僵菌HFW-05菌株在田间的作物叶片上和土壤中均可以很好的定殖,为解决球孢白僵菌HFW-05菌株在田间环境下大规模的推广和应用提供了科学依据。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 引言  10-17
  1.1 白僵菌的分类及生物学特征  10-11
  1.2 球孢白僵菌的致病机理  11
  1.3 球孢白僵菌的分类鉴定方法  11-12
  1.4 环境条件对白僵菌的影响  12-13
    1.4.1 温度湿度对白僵菌的影响  12
    1.4.2 pH 值对白僵菌的影响  12
    1.4.3 紫外线照射对白僵菌的影响  12-13
  1.5 白僵菌多样性研究的意义  13-14
  1.6 白僵菌分子生物学研究进展  14-16
  1.7 拟研究目标与内容  16-17
第二章 白僵菌的生物特性与孢子萌发特性  17-28
  2.1 试验材料与试剂  17-19
    2.1.1 供试菌株  17
    2.1.2 培养基  17-18
    2.1.3 试验仪器  18
    2.1.4 主要使用试剂  18-19
  2.2 试验方法  19-20
    2.2.1 白僵菌菌株基因组序列的提取  19
    2.2.2 白僵菌菌株的ITS 序列扩增  19
    2.2.3 菌落生长速度与产孢量的测定  19-20
    2.2.4 孢子萌发率及芽管长度测量  20
    2.2.5 数据处理  20
  2.3 结果与分析  20-27
    2.3.1 白僵菌菌株培养特性结果  20-21
    2.3.2 菌株基因组序列的提取与ITS 序列电泳图结果  21-22
    2.3.3 白僵菌菌株ITS 序列BALST 比对结果与系统进化树  22-24
    2.3.4 15 株球孢白僵菌的培养特征  24-25
    2.3.5 球孢白僵菌孢子萌发特征  25-26
    2.3.6 球孢白僵菌培养特征与孢子萌发特征之间的相关性分析  26-27
  2.4 结论与讨论  27-28
第三章 白僵菌的酯酶同工酶酶谱  28-34
  3.1 试验材料与试剂  28-29
    3.1.1 供试菌株  28
    3.1.2 所用试剂  28-29
  3.2 试验方法  29-30
    3.2.1 球孢白僵菌全蛋白溶液的制备  29
    3.2.2 垂直非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳  29-30
    3.2.3 数据处理与聚类分析  30
  3.3 结果与分析  30-33
    3.3.1 球孢白僵菌菌丝体全蛋白的相对迁移率  30
    3.3.2 球孢白僵菌的酯酶同工酶酶谱  30-31
    3.3.3 球孢白僵菌同工酶酶带的编号代码  31
    3.3.4 球孢白僵菌同工酶酶带的相似系数和聚类分析图  31-33
  3.4 结论与讨论  33-34
第四章 白僵菌的RAPD-PCR 遗传多样性分析  34-44
  4.1 材料与试剂  34
    4.1.1 试剂  34
    4.1.2 供试菌株  34
  4.2 试验方法  34-36
    4.2.1 白僵菌基因组DNA 提取  34-35
    4.2.2 DNA 浓度和质量检测  35
    4.2.3 RAPD 扩增反应及检测  35-36
  4.3 结果与分析  36-42
    4.3.1 球孢白僵菌基因组DNA 琼脂糖检测  36-37
    4.3.2 球孢白僵菌RAPD 扩增产物的多态性  37-41
    4.3.3 球孢白僵菌白僵菌RAPD 的相似系数与聚类分析结果  41-42
  4.4 结论与讨论  42-44
第五章 白僵菌HFW-05 在植株叶片与土壤中的宿存动态研究  44-60
  5.1 试验材料与试剂  44-45
    5.1.1 菌株  44
    5.1.2 试验地点及作物  44-45
    5.1.3 培养基配置  45
  5.2 试验方法  45-47
    5.2.1 选择性培养基的选择  45
    5.2.2 HFW-05 在植株叶片和叶肉的动态变化研究  45-46
    5.2.3 HFW-05 在灭菌土与非灭菌土内的动态变化研究  46-47
  5.3 结果与讨论  47-59
    5.3.1 HFW-05 在番茄黄瓜洋白菜叶片表面上的定殖种群动态  47-51
    5.3.2 HFW-05 对番茄黄瓜洋白菜叶片表面的微生物种群的影响  51
    5.3.3 HFW-05 在番茄黄瓜洋白菜叶片叶肉中的定殖种群动态  51-55
    5.3.4 HFW-05 对番茄黄瓜洋白菜叶肉中微生物种群的影响  55-56
    5.3.5 HFW-05 在灭菌土与非灭菌土中的定殖种群动态及其对土壤微生物种群的影响  56-59
  5.4 结果与讨论  59-60
第六章 结论  60-61
参考文献  61-67
在读期间发表论文  67-68
作者简历  68-69
致谢  69-70

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用 > 昆虫真菌
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