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柑橘碎叶病毒侵染性克隆构建及其诱导的基因沉默（VIGS）体系建立

作　者: 宋震
导　师: 周常勇; 李中安
学　校: 西南大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘碎叶病毒 侵染性克隆 病毒诱导的基因沉默 限制性片段长度多态性 逆转录巢式聚合酶链式反应
分类号: S436.66
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


柑橘是世界第一大水果。我国柑橘栽培面积超过290万公顷,产量达3000万吨,均居世界第一位。随着克里曼丁红橘(Citrus clementina Hort. ex Tan)和甜橙(C. sinensis cv. Valencia)全基因组序列的公布,以及柑橘抗病、抗逆等相关基因序列表达标签(Expressed sequence tags, EST)的大量累积,柑橘基因功能解析已成为目前的研究热点和挑战之一。病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)是近年来发展的一种基因功能研究工具,与转基因、基因敲除、反义抑制等常用生物技术相比,试验周期短,不需要遗传转化,具有操作简便、成本低、高通量等优势。利用VIGS技术有望克服柑橘这种多年生木本作物童期长、遗传转化困难等瓶颈,加速其基因功能研究的进展。为此,本研究在柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)检测方法及多态性研究的基础上,筛选CTLV分离株进行全基因组cDNA扩增、侵染性克隆构建,并进一步开展了在模式植物本生烟(Nicotiana benthamiana)上建立VIGS体系的研究,以期为在柑橘上实施VIGS进而研究其基因功能奠定基础。主要研究结果如下：1. CTLV一步法及巢式RT-PCR检测体系建立通过引物比对,建立了CTLV的一步法及巢式RT-PCR检测体系。其中,一步法RT-PCR产物889bp,包含整个CP及3’UTR序列,比目前的常规RT-PCR操作简便,污染几率小；巢式RT-PCR检测灵敏度高,比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度约1.27pg/μL。2. CTLV多态性分析建立了CTLV分子变异的Hinf Ⅰ/RFLP检测体系,定义RFLP组群9个,发现CTLV以单一RFLP组群侵染为主,其中RFLP Ⅰ和RFLP Ⅱ组群可能是优势流行组群,但也存在混合侵染。该体系简便、快速、重复性好,可用于大规模样品的分子变异检测。对收集保存的18份CTLV分离株进行了指示植物鉴定、3’端序列分析及RFLP检测。结果表明,在指示植物腊斯克枳橙(C. sinensis×Poncirus trifoliata cv. Rusk)上表现弱到中等强度症状的6个分离株均属于或携带有RFLP Ⅱ或RFLPⅢ组群,而其它RFLP组群均表现出强毒株特征。在根据3’端序列(889bp)构建的系统进化树上,CTLV分离株聚为了2个同源性组群,同源性组群A包含的8个序列均为RFLP Ⅱ或RFLP Ⅲ组群；同源性组群B则包含了其它RFLP组群的所有序列。同时,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在A组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物则划分在B组群。可见,指示植物上的弱(中)毒分离株侵染症状-RFLPⅡ或RFLPⅢ组群-同源性A组群三者之间可能存在某种内在联系。RFLP组群检测可用于研究CTLV的分子变异,对于快速鉴定CTLV致病性强弱可能具有参考价值。3. CTLV基因组全长cDNA扩增及序列分析在通过RACE技术获得末端精确序列的基础上,建立了CTLV全长的RT-PCR体系,进而扩增并克隆了CTLV新会橙分离株及满头红分离株基因组全长cDNA。序列分析表明,CTLV-XHC(登录号KC588947)和CTLV-MTH(登录号KC588948)基因组全长均为6497nt[不包括3’poly(A)尾巴],均包含2个开放读码框,在推定的CP及MP上游均具有保守的亚基因组启动子核心序列‘’UUAGGU",与目前已报道的CTLV及苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)的基因组结构一致。同登录GenBank的所有CTLV及ASGV全基因组序列比对显示,CTLV-XHC与我国砂糖橘分离株CTLV-S序列一致性最高,为98%,在依据全基因组核苷酸序列构建的系统进化树上,CTLV-XHC与柑橘来源的CTLV分离株聚为一簇；有趣的是,CTLV-MTH与日本ASGV分离物序列一致性最高,为91%,而与台湾甜橙分离株CTLV-LC一致性最低,为82.0%,在系统进化树上CTLV-MTH与多数ASGV分离株聚为一簇。这一结果对于CTLV与ASGV的起源进化关系具有启示意义。4. CTLV侵染性克隆构建对6个CTLV基因组全长cDNA克隆进行体外转录并摩擦接种昆诺藜(Chenopodium quinoa),症状观察及RT-PCR检测结果表明,CTLV-XHC和CTLV-MTH的体外转录物具有侵染性。为获得适于农杆菌介导接种的CTLV侵染性克隆,以pCAMBIA1301为骨架构建了双元植物表达载体pCSSN:LB-2x35S-MCS-NOS-RB,通过瞬时表达GFP验证其有效性后,采用分步克隆策略将CTLV-XHC和CTLV-MTH分别插入到pCSSN载体2x35S启动子与NOS终止子之间。经筛选、鉴定获得了CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC和pCSSN-MTH。农杆菌介导的本生烟(N. benthamiana)注射接种实验表明,二者的侵染症状与野生型病毒对照无明显差异,接种时共表达沉默抑制子p19提高了pCSSN-XHC和pCSSN-MTH的侵染率。5. CTLV诱导的VIGS体系建立以CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC为基础,通过重组克隆在CP终止子之后引入NruⅠ识别序列,构建了VIGS载体pCTLV-00:LB-2x35S-XHC(Nru Ⅰ)-NOS-RB。反向插入402bp源于本生烟的八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)基因片段后,重组载体pCTLV-PDS402R通过农杆菌浸润接种本生烟,在22℃光照16h和20℃黑暗8h周期条件下,诱导产生了PDS基因沉默的白化表型。Real-time RT-PCR检测结果表明,pCTLV-PDS402R侵染植株PDS基因的相对表达量比空载体pCTLV-00对照下降约25%。说明基于CTLV上的VIGS体系初步建立。为提高VIGS沉默效率,引入具有自我剪切功能的核酶序列到pCTLV-00,构建了VIGS载体pCTLV1:LB-2x35S-XHC(Nru Ⅰ)-RZ-NOS-RB;进一步分别引入135bp、105bp、90bp和61bp的CP亚基因组启动子片段构建了VIGS载体pCTLV2、pCTLV3、 pCTLV4、pCTLV5。上述系列VIGS载体均反向插入了PDS基因片段,基因沉默效应正在评估当中。

全文目录


摘要  7-10
Abstract  10-14
第一章 文献综述  14-40
  1.1 柑橘碎叶病毒(CITRUS TATTER LEAF VIRUS,CTLV)研究进展  14-22
    1.1.1 CTLV的发生与为害  14-15
    1.1.2 CTLV的侵染症状  15
    1.1.3 CTLV的寄主范围及传播途径  15-16
    1.1.4 CTLV的分类地位  16
    1.1.5 CTLV的分子生物学特性  16-17
    1.1.6 CTLV的检测方法  17-19
    1.1.7 CTLV的多态性  19-21
    1.1.8 CTLV的防治  21-22
  1.2 植物RNA病毒侵染性克隆研究进展  22-28
    1.2.1 病毒基因组的cDNA合成  22
    1.2.2 病毒侵染性克隆的构建  22-24
    1.2.3 影响病毒全基因组cDNA侵染活性的因素  24-28
    1.2.4 植物病毒侵染性克隆的应用  28
  1.3 病毒诱导的基因沉默(VIRUS-INDUCED GENE SILENCING,VIGS)研究进展  28-40
    1.3.1 VIGS的机制  29-32
    1.3.2 VIGS的技术发展  32-35
    1.3.3 影响VIGS效率的因素  35-37
    1.3.4 VIGS的优势和局限性  37-38
    1.3.5 VIGS的应用  38-40
第二章 引言  40-44
  2.1 研究背景  40-42
  2.2 研究目的及意义  42
  2.3 研究内容  42-44
第三章 柑橘碎叶病毒多态性分析  44-60
  3.1 实验材料  44-45
  3.2 实验方法  45-48
  3.3 结果与分析  48-56
    3.3.1 一步法RT-PCR  48-49
    3.3.2 巢式RT-PCR  49-51
    3.3.3 指示植物鉴定  51-52
    3.3.4 3'端序列分析  52-53
    3.3.5 限制性片段长度多态性(RFLP)分析  53-56
  3.4 讨论  56-60
第四章 CTLV全长CDNA克隆及序列分析  60-80
  4.1 试验材料  60-61
  4.2 试验方法  61-66
  4.3 结果与分析  66-77
    4.3.1 总核酸提取  66
    4.3.2 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)  66-68
    4.3.3 CTLV全基因组的RT-PCR  68-70
    4.3.4 CTLV全基因组cDNA的克隆及鉴定  70
    4.3.5 CTLV全基因组测序及序列拼接  70-72
    4.3.6 CTLV全基因组序列分析  72-73
    4.3.7 CTLV基因组ORF及类亚基因组启动子分析  73-75
    4.3.8 CTLV的二级结构  75-77
  4.4 讨论  77-80
第五章 CTLV侵染性克隆构建  80-96
  5.1 实验材料  80-81
  5.2 试验方法  81-85
  5.3 试验结果  85-93
    5.3.1 CTLV全长cDNA的侵染性鉴定  85-87
    5.3.2 双元表达载体pCSSN的构建  87-88
    5.3.3 pCSSN-XHC的构建  88-90
    5.3.4 pCSSN-MTH的构建  90-91
    5.3.5 农杆菌介导的pCSSN-XHC及pCSSN-MTH侵染性鉴定  91-93
  5.4 讨论  93-96
第六章 CTLV诱导的VIGS体系建立  96-106
  6.1 实验材料  96-97
  6.2 试验方法  97-99
  6.3 试验结果  99-104
    6.3.1 VIGS载体pCTLV-00的构建  99-100
    6.3.2 重组载体pCTLV-PDS402R的构建  100-101
    6.3.3 pCTLV-PDS402R接种及RT-PCR检测  101
    6.3.4 pCTLV-PDS402R诱导的基因沉默效应分析  101-103
    6.3.5 VIGS体系优化  103-104
  6.4 讨论  104-106
第七章 结论  106-108
参考文献  108-126
附录Ⅰ pCTLVl全序列  126-132
附录Ⅱ 英文缩略表  132-133
附录Ⅲ 论文涉及的病毒缩写及中英文对照表  133-134
攻读博士学位期间的科研项目及成果论文  134-136
致谢  136

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害
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