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中国柑橘黑斑病相关的叶点霉属真菌种类、遗传多样性和快速诊断技术研究

作　者: 王兴红
导　师: 李红叶
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘黑斑病 Phyllosticta 种类鉴定 种特异性引物 巢式多重PCR 遗传多样性
分类号: S436.661.12
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


柑橘黑斑病(Citrus Black Spot, CBS),也称黑星病,病原的有性态为柑橘球座菌(Guignardia citricarpa Kiely),属子囊菌门,座囊菌目；无性态为柑橘叶点霉菌(Phyllosticta citricarpa (McAlpine) van der Aa),属半知菌类,腔孢纲,球壳孢目。病菌主要危害果实,在果皮上形成病斑导致鲜果的商品性下降,甚至无法上市鲜售。CBS病菌被欧盟列为A1类严禁入境的有害生物,也是美国严禁入境的有害生物,因此是包括我国在内有黑斑病发生国家柑橘鲜果出口的重要障碍。尽管我国是柑橘的原产地之一,栽培柑橘种类繁多,黑斑病发生普遍,但对不同类型柑橘的黑斑病菌病原种类是否一致,以及病菌的生物学特性和分子变异并无研究。本研究从我国柑橘主产区几大栽培柑橘上收集黑斑病或疑似黑斑病症状的果实和叶片,分离培养获得代表性菌株若干,在此基础上开展这些代表性菌株的种类鉴定、种内遗传多样性分析,以及种特异性引物的筛选和相关的PCR鉴定体系的建立。主要研究结果如下：1.建立了P. citriasiana的分子鉴定技术在ITS1区域设计了针对于亚洲柑橘叶点霉菌P. citriasiana的特异性上游引物Pca8,结合下游引物ITS4,建立了准确、灵敏和快速鉴定P. citriasiana的PCR体系。利用该体系可从P. citriasiana菌株中扩增出488bp的特异性条带,而不能从柑橘叶点霉菌P. citricarpa和首都叶点霉菌P. capitalensis(-一种内生菌),以及其他柑橘常发病害病原菌中扩增出条带。该体系检测P. citriasiana DNA最低为12pg,整个过程可在3小时内完成。2.明确了中国柑橘上叶点霉属真菌种类自2007-2011年,从我国10个省市的宽皮橘(Citrus reticulata)、柚(C. maxima)、葡萄柚(C. paradisi)、甜橙(C. sinensis)以及柠檬(C. limon)等具典型或非典型黑斑病症状的果实和叶片上分离获得496个Phyllosticta菌株。通过形态学比较,可将这些菌株分为4类。选择74个代表性菌株,克隆测定其18S rDNA和28S rDNA的部分区域、核糖体DNA的两个转录间隔区及其中的5.8S亚基(internal transcribed spacer, ITS)、肌动蛋白(Actin,ACT),延长因子(translation elongation factor-1alpha, TEF1),β微管蛋白(β-tubulin, Tub)和钙调蛋白(calmodulin, Cal)基因的部分序列,单独或合并后构建系统进化树,结果发现这74个菌株分为4个明显的分支。其一为P. citricarpa,即被欧盟和美国列为检疫对象的柑橘叶点霉菌。该病菌的寄主有宽皮橘、甜橙和柠檬,但没有从柚上发现；其二为P. citriasiana,引起柚黑斑病(也被称为棕褐斑病,‘’tan spot"),寄主为沙田柚和琯溪蜜柚,但未从其他柑橘种上发现；其三是P. capitalensis,即一种内生菌,可从本研究中的各种柑橘的有症或无症材料上获得；其四是一个有别于已有的Phyllosticta spp.,本文暂时将之定为Phyllosticta citrichinaensis X.H. Wang, K.D. Hyde&H.Y. Li。该菌可从本研究中的各种柑橘的非典型黑斑病症状的材料上获得。在这4个Phyllosticta spp中,P. citrichinaensis的分生孢子最小,附属丝最长,短杆状孢子和子囊孢子最大；P. citrichinaensis在PDA, CMA和MEA培养基表面形成具有多个环形凹槽的菌落,在OA培养基上不产生黄色素；当以葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糖分别作为唯一碳源时,P.citrichinaensis生长较差,菌落直径小于其他三种Phyllosticta;当以尿素、酒石酸铵、天门冬氨酸、乙酸铵、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3、胰蛋白胨、脯氨酸、甘氨酸分别作为唯一氮源时,P. citrichinaensis生长最差,菌落直径均小于其他三个Phyllosticta种,且P. citrichinaensis几乎不能利用尿素、酒石酸铵、天门冬氨酸、乙酸铵、(NH4)2SO4、NH4NO3; P. citrichinaensis生长pH范围为3.0-6.0,最适为4.0,其次为3.0。在pH为3.0-5.0的PDA培养基上, P. citrichinaensis比P.citriasiana和P. citricarpa生长快,但比P. capitalensis生长慢。3.建立巢式多重PCR鉴定柑橘上四种叶点霉属真菌的技术体系比较4种叶点霉属真菌的ITS1及18S区域序列,设计并筛选了针对P. citrichinaensis、P. citricarpa、P. capitalensis和P. citriasiana特异性上游引物Pcc1、Pc1、Pct4和Pea8(见1),并均以通用引物ITS4作为下游引物。以已知该4种菌的菌株DNA作为对照,首先使用ITS4/ITS5对供试菌株进行第一轮扩增,PCR产物稀释50-100倍后,同时加入引物对Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pca8/ITS4,在退火温度为60℃条件下进行第二轮PCR扩增,通过扩增条带与已知种菌株的相应扩增条带大小的比较,确定待测样品所属的叶点霉属菌的种类。该体系的灵敏度达到2ag的DNA。与传统PCR相比其灵敏度至少提高106倍。不仅可用于试验室培养的待测菌株的鉴定,还可以用于果实疑似黑斑病的病斑快速鉴定。4.明确了中国柑橘叶点霉属真菌遗传多样性通过对影响PCR反应的主要成分模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶及引物等条件的优化,建立了适合柑橘叶点霉菌的ISSR-PCR反应体系。利用该体系从100条引物中筛选出11条扩增条带稳定、清晰、重复性好和多态性高的引物。利用筛选的11条引物和优化的ISSR-PCR体系,对供试的110个来自柑橘的叶点霉属菌株进行扩增,共扩增出197个条带,多态性条带为194个,多态率为98.5%,证明中国柑橘上叶点霉属真菌遗传多样性丰富。利用NTSYS-pc2.10软件对扩增的条带进行分析并构建UPGMA聚类图,显示中国柑橘叶点霉属真菌可以分为四个分支,每分支对应着P. citricarpa, P.citriasiana, P. capitalensis和P. citrichinaensis。P. citricarpa的遗传分化与寄主种类相关,而与地理来源无关。来自甜橙和柠檬的菌株与来自宽皮柑橘的菌株分布在不同的分支中,而来自砂糖橘的菌株又聚为一个分支。而P. citriasiana, P. capitalensis和P. citrichinaensis(?)中群内的遗传变异与地理距离和寄主均无相关性。

全文目录


致谢  6-10
摘要  10-13
Abstract  13-17
第一章 文献综述和研究背景  17-39
  1. 柑橘黑斑病的研究背景  17-27
    1.1 柑橘黑斑病的发生历史、国内外分布和危害性  17-20
      1.1.1 病害的国内外发生历史  17
      1.1.2 病害的分布  17-18
      1.1.3 病害的危害性及病害在我国的研究进展  18-20
        1.1.3.1 病害的危害性  18-19
        1.1.3.2 病害在我国的研究进展  19-20
    1.2 柑橘黑斑病的症状特点  20
    1.3 柑橘黑斑病的病原种类  20-23
      1.3.1 柑橘叶点霉菌(P.citricarpa)和首都叶点霉菌(P.capitalensis)  20-21
      1.3.2 亚洲柑橘叶点霉菌P.citriasiana  21-22
      1.3.3 巴西柑橘叶点霉菌(P.citribraziliensis)  22-23
    1.4 病害的发生规律  23-24
      1.4.1 病害的初侵染来源  23-24
      1.4.2 病害的传播  24
      1.4.3 气候条件对病害流行的作用  24
    1.5 病害的诊断与检测  24-25
    1.6 病害的风险  25-26
    1.7 病害的防治  26-27
  2、叶点霉属真菌的研究进展  27-30
    2.1 叶点霉属的建立和演变  27
    2.2 叶点霉属真菌种的分类和种类  27-29
      2.2.1 叶点霉属真菌种的分类依据  27-28
      2.2.2 叶点霉属的种类  28-29
    2.3 叶点霉属和球座菌属真菌命名  29-30
  3、植物病原菌的分子快速诊断技术的研究进展  30-32
    3.1 核糖体DNA的转录间隔区序列的应用  30-31
    3.2 特异性扩增核糖体DNA内转录间隔区PCR技术及应用  31-32
  4、植物病原真菌的种群遗传多样性及其研究技术  32-37
    4.1 物种遗传多样性形成的原因及研究的意义  32-33
      4.1.1 物种遗传多样性形成的原因  32-33
      4.1.2 研究物种遗传多样性的意义  33
    4.2 研究遗传多样性的方法  33-35
    4.3 分子标记技术在叶点霉属真菌中的应用  35-37
  5、本研究的背景、意义和研究内容  37-39
第二章 中国柑橘黑斑病菌及其叶点霉属真菌的种类  39-86
  1. 前言  39-42
  2. 材料与方法  42-47
    2.1 试验材料  42
    2.2. 试验方法  42-47
      2.2.1 菌株分离纯化  42
      2.2.2 病原菌形态与培养性状  42
      2.2.3 基因组DNA的提取  42-43
      2.2.4 PCR扩增、克隆、测序和引物设计  43-44
      2.2.5 引物筛选与引物特异性检验  44
      2.2.6 特异性引物的灵敏度检验  44
      2.2.7 果园疑似柚黑斑病症状的病斑检测  44-45
      2.2.8 种特异性引物鉴定病原菌  45
      2.2.9 代表性菌株系统进化树的构建  45
      2.2.10 温度对四种叶点霉属真菌的生长影响  45-46
      2.2.11 生物化学特性  46-47
        2.2.11.1 四种叶点霉属真菌对碳源利用比较  46
        2.2.11.2 四种叶点霉属真菌对氮源利用比较  46
        2.2.11.3 四种叶点霉属真菌对pH的反应比较  46-47
  3 结果与分析  47-83
    3.1 分离结果  47
    3.2 供试菌株的形态学鉴定  47-51
    3.3 P.citricarpa、P.capitalensis和P.citriasiana ITS序列测定与分析及引物设计  51-53
    3.4 引物筛选结果  53
    3.5 灵敏度检测结果  53
    3.6 特异性引物对果实病斑中亚洲柑橘叶点霉菌的检验  53-54
    3.7 种特异性引物对分离菌株的鉴定结果  54-57
    3.8 系统进化树的构建  57-68
      3.8.1 基于ITS序列构建的系统进化树  57-63
      3.8.2 基于肌动蛋白基因ACT构建的系统进化树  63
      3.8.3 基于延长因子基因TEF1序列构建的系统进化树  63-66
      3.8.4 基于β-微管蛋白基因Tub和钙调蛋白基因Cal构建的系统进化树  66
      3.8.5 基于ITS,ACT和TEF1基因组合序列构建的系统进化树  66-68
    3.9 叶点霉属新种Phyllosticta citrichinaensis的形态学描述  68-73
    3.10 四种叶点霉属菌株在不同培养基上的培养性状  73-75
    3.11 三种叶点霉属菌株在果实或叶片上引起的症状  75-79
      3.11.1 P.citrichinaensis在柑橘果实和叶片上产生的症状  75
      3.11.2 P.citricarpa在宽皮柑橘、甜橙和柠檬果实上引起的症状  75
      3.11.3 P.citriasiana在柚果实和叶片上引起的症状  75-79
    3.12 P.citrichinaensis、P.citricarpa、P.citriasiana和P.capitalensis生长温度  79
    3.13 四种叶点霉属菌株生物学特性  79-83
      3.13.1 四种叶点霉属菌株对不同碳源的利用情况  79
      3.13.2 四种不同叶点霉属菌株对氮源的利用  79-80
      3.13.3 四种叶点霉属菌株在不同pH培养基上生长状况  80-83
  4 结论与讨论  83-86
第三章 鉴定柑橘上三种叶点霉属真菌的特异性引物筛选和巢式四重PCR鉴定体系建立  86-100
  1. 前言  86-88
  2. 材料与方法  88-92
    2.1 供试菌株及其培养  88
    2.2 基因组DNA的提取  88
    2.3 P.citricarpa,P.citrichinaensis和P.capitalensis特异性引物的设计  88-91
    2.4 P.citricarpa,P.citrichinaensis和P.capitalensis引物的特异性检测及目的条带的克隆  91
    2.5 特异性引物灵敏度检验  91
    2.6 柑橘叶点霉属巢式PCR体系优化  91
    2.7 果园具有疑似柑橘黑斑病症状的果实和叶片检测  91-92
  3 结果与分析  92-99
    3.1 特异性引物和相应的退火温度筛选  92
    3.2 引物特异性检验  92-94
    3.3 特异性引物灵敏度检测结果  94-96
    3.4 巢式PCR体系优化  96-97
    3.5 巢式多重PCR灵敏度测定结果  97-98
    3.6 果园具有疑似柑橘黑斑病症状的果实和叶片检测  98-99
  4 结论和讨论  99-100
第四章 中国柑橘上的叶点霉属真菌遗传多样性研究  100-121
  1 前言  100-102
  2 材料和方法  102-106
    2.1 菌株来源  102-105
    2.2 菌丝基因组DNA的提取  105
    2.3 ISSR反应体系的优化  105-106
      2.3.1 ISSR反应体系各成分用量研究  105
      2.3.2 ISSR反应程序  105
      2.3.3 引物筛选及遗传多样性分析  105-106
  3 结果与分析  106-119
    3.1 叶点霉属真菌菌丝基因组总DNA的质量  106
    3.2 反应体系优化结果  106-110
      3.2.1 Mg~(2+)对ISSR-PCR扩增结果的影响  106-107
      3.2.2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响  107
      3.2.3 引物浓度对ISSR-PCR反应的影响  107-108
      3.2.4 TaqDNA聚合酶用量对ISSR-PCR反应的影响  108
      3.2.5 模板DNA用量对ISSR-PCR反应的影响  108-110
      3.2.6 最佳柑橘叶点霉属真菌ISSR-PCR体系的建立  110
      3.2.7 建立的柑橘叶点霉属真菌ISSR-PCR反应体系的稳定性检验  110
    3.3 ISSR-PCR引物的筛选  110-112
    3.4 ISSR图谱分析  112-117
    3.5 ISSR聚类分析  117-119
  4 结论与讨论  119-121
第五章 全文总结和有待研究问题  121-124
参考文献  124-132

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