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卵携带的微生物对亮斑扁角水虻产卵行为和生长发育的影响

作　者: 郑龙玉
导　师: 喻子牛
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 亮斑扁角水虻废弃物处理微生物多样性焦磷酸测序产卵引诱剂生长发育生物柴油
分类号: S186
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

亮斑扁角水虻(Hermetta illucens L.,简称水虻)可以可持续地处理动植物有机废弃物。水虻幼虫能够在大幅减少畜禽粪便等废弃物累积量的同时,消除废弃物携带的多种病原菌类、除臭及抑制家蝇滋生。通过转化废弃物营养得到的水虻虫体可以作为畜禽、水产动物等的优质蛋白饲料来源。本研究较全面地调查了水虻种群携带的细菌群落结构及其多样性,卵携带的微生物在水虻聚集产卵行为中的作用及其对水虻生长发育的重要性,最后对水虻虫体油脂作为生物柴油生产的新型生物质原料进行了初步探索,主要结果如下：(1)亮斑扁角水虻各连续生命阶段的细菌种群多样性利用16SrDNA-454焦磷酸测序技术,调查了水虻各个连续生命阶段的细菌多样性：从水虻各生命阶段一共获得了4852个PCR产物,从第一代卵、幼虫、预蛹、蛹、成虫和次代卵样品获得的序列数目分别为37、517、1181、2106、883和128。在≥80%自引支持度(bootstrap support)下,分类到门、纲、目、科、属水平的序列百分比分别为99.65%、97.34%、85.84%、69.31%和31.55%。各生长阶段完成分类的(99.67%)综合细菌多样性跨越了6个细菌门。拟杆菌门和变形菌门占到了所鉴定类群的三分之二,是最具优势的菌门。在水虻卵阶段发现的细菌中有大约15%为第一代卵和次代卵所共有,暗示着世代垂直传递的可能性。(2)卵表细菌介导亮斑扁角水虻的聚集产卵行为通过产卵地点选择测试(OSP),在室内考察了各潜在因素在水虻产卵行为中的作用。结果表明,收卵基质对水虻具有长距离吸引作用,同种新生虫卵可以刺激怀卵雌性聚集产卵；而后通过对消毒虫卵进行OSP测试,发现卵表细菌是产卵刺激效果的主要来源。在对卵分离细菌进行OSP测试后,确定起关键作用的是一个细菌复合体(BSF-4),其中有4株菌,分别属于戈登氏菌属(Gordonia sp.)、纤维单胞菌属(Cellulomonas sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)和微球菌属(Micrococcus sp.),它们对水虻产卵都具有吸引作用,戈登氏菌作用最显著,但BSF-4复合体作用效果强于任何单株细菌,4株菌可能具有协同作用。另外,部分水虻虫卵分离细菌和异种昆虫(自然界潜在竞争者)源细菌对水虻产卵行为表现出抑制排斥作用。(3)卵表微生物对亮斑扁角水虻生长发育特性的影响通过对虫卵进行表面消毒获得了无菌幼虫,然后测定了在喂食相同无菌人工饲料条件下无菌幼虫与正常幼虫生活史特性的差异,并通过向无菌幼虫回接虫卵洗液和卵表分离细菌混合液验证微生物对于水虻生长发育的重要性。结果显示,无菌幼虫预蛹率和存活到成虫阶段的比率均显著低于正常幼虫,仅有57.5%能够成功羽化；无菌幼虫发育出现延迟,发育时间延长了50%以上,需近30d才能预蛹,预蛹重量降低；无菌幼虫的预蛹需更长时间才能羽化,得到的成虫均重显著低于正常幼虫,成虫平均寿命只有9d左右,显著短于正常幼虫。在回接卵洗液和混合菌液后,无菌幼虫各项指标均向正常幼虫靠拢,部分得到了显著改善,证实卵表细菌对于水虻幼虫生长发育至关重要。(4)亮斑扁角水虻虫体脂肪成分作为新型生物能源材料综合地评测了利用水虻幼虫降解转化固态餐厨剩余物来再次生产生物柴油的潜力。结果显示,1000头水虻幼虫(8d)接种到1kg固态餐厨剩余物中,经过7d的生长消化,最后可以生产得到大约23.6g的水虻基生物柴油,使得利用餐厨剩余物生产生物柴油的产率提高了近一倍(回收油脂：2.7%：水虻油脂：2.4%)。此水虻基生物柴油的大多数性能参数均已达到了欧盟关于生物柴油的标准(EN14214),其中包括密度(860kg/m3)、粘度(4.9mm2/s)、闪点(128℃)、十六烷值(58)、酯含量(96.9%)等。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-14
縮略语表  14-15
第一章文献综述  15-35
  1.1 昆虫-微生物共生关系  15-23
    1.1.1 微生物共生普遍存在  15
    1.1.2 昆虫-微生物共生类型及研究进展  15-17
    1.1.3 参与共生关系的益处(共生菌和宿主)  17-19
      1.1.3.1 代谢和营养  17-18
      1.1.3.2 克服寄主防御  18
      1.1.3.3 抵御天敌  18-19
      1.1.3.4 调控生殖及信号传导  19
    1.1.4 共生体传递模式  19-21
      1.1.4.1 内共生体  19-20
      1.1.4.2 外共生体-肠道共生体  20-21
      1.1.4.3 其他特殊模式  21
    1.1.5 宿主调控内共生体的机制  21-22
      1.1.5.1 溶酶体机制  21
      1.1.5.2 血细胞机制  21-22
      1.1.5.3 内分泌机制  22
      1.1.5.4 抗菌肽机制  22
    1.1.6 共生成员的协同进化  22-23
  1.2 昆虫的寄主选择及产卵行为调控  23-28
    1.2.1 昆虫寄主选择行为的感官调控  23-24
    1.2.2 昆虫寄主选择行为的化学信号调控  24-28
      1.2.2.1 来自寄主的气味物质  24-25
      1.2.2.2 同种或异种动物产生的气味物质  25-26
      1.2.2.3 微生物化学信息素介导的昆虫行为调控  26-28
  1.3 亮斑扁角水虻相关研究进展  28-33
    1.3.1 亮斑扁角水虻简介  28-29
      1.3.1.1 亮斑扁角水虻分类地位及分布  28
      1.3.1.2 亮斑扁角水虻形态特征  28-29
    1.3.2 亮斑扁角水虻生活史  29
    1.3.3 人工繁殖技术及影响因素  29-30
    1.3.4 亮斑扁角水虻有机废弃物资源化利用  30-31
      1.3.4.1 废弃物处理系统  30
      1.3.4.2 可行性分析  30-31
    1.3.5 水虻有机废弃物处理系统的附加值  31-32
      1.3.5.1 抑制家蝇滋生  31
      1.3.5.2 消除病原微生物  31
      1.3.5.3 抗菌肽  31
      1.3.5.4 水虻油脂作为新型生物能源材料  31-32
    1.3.6 水虻营养价值及其动物饲料应用  32
    1.3.7 法医学中的水虻  32
    1.3.8 水虻生物学及生态学研究进展  32-33
  1.4 本研究的提出及其目的和意义  33-35
    1.4.1 本研究的提出  33
    1.4.2 本研究目的和意义  33-35
第二章亮斑扁角水虻各连续生命阶段的细菌多样性  35-64
  2.1 前言  35-36
  2.2 材料与方法  36-38
    2.2.1 水虻种群来源  36
    2.2.2 水虻种群维持方法  36
    2.2.3 水虻各生命阶段样品采集  36
    2.2.4 样品总DNA提取  36-37
    2.2.5 16S rRNA基因454 FLX-Titanium焦磷酸测序  37
    2.2.6 测序结果分析  37-38
  2.3 结果与分析  38-45
    2.3.1 测序总体特征  38-39
    2.3.2 序列的分类学分布  39-40
    2.3.3 菌群丰富度和多样性指数  40-45
    2.3.4 邻接法聚类分析  45
  2.4 讨论  45-49
  2.5 主要结论  49-64
第三章卵表细菌对亮斑扁角水虻产卵行为的调控作用  64-82
  3.1 前言  64-65
  3.2 材料与方法  65-73
    3.2.1 供试昆虫来源  65-66
    3.2.2 昆虫种群维持  66
      3.2.2.1 水虻种群  66
      3.2.2.2 拟步甲虫种群  66
      3.2.2.3 次生锥蝇和毛蛆蝇种群  66
    3.2.3 水虻虫卵消毒及无菌幼虫培养  66-68
      3.2.3.1 虫卵消毒步骤  66-67
      3.2.3.2 消毒效果验证  67-68
    3.2.4 细菌分离纯化及初步鉴定  68
    3.2.5 细菌分子鉴定  68-69
      3.2.5.1 DNA模板制备  68
      3.2.5.2 16S rDNA PCR扩增  68-69
      3.2.5.3 测序和序列比对菌株鉴定  69
    3.2.6 亮斑扁角水虻产卵地点选择测试(OSP)  69-73
      3.2.6.1 同种虫卵和产卵培养基质对水虻产卵行为的影响  70-71
      3.2.6.2 虫卵消毒对水虻产卵影响的变化  71
      3.2.6.3 不同细菌对水虻产卵的影响  71-73
    3.2.7 统计分析  73
  3.3 结果与分析  73-79
    3.3.1 收卵基质对水虻产卵行为的长距引诱作用  73
    3.3.2 同种虫卵对水虻产卵的短距刺激作用  73-74
    3.3.3 卵携带微生物参与水虻产卵行为调控  74
    3.3.4 妊娠雌性水虻对分离培养的细菌的产卵响应  74-79
      3.3.4.1 对异种来源细菌的产卵响应  74-75
      3.3.4.2 对同种来源细菌的产卵响应  75-79
  3.4 讨论  79-80
  3.5 主要结论  80-82
第四章卵表微生物对亮斑扁角水虻生长发育特性的影响  82-94
  4.1 前言  82-83
  4.2 材料与方法  83-86
    4.2.1 供试水虻种群  83
    4.2.2 水虻虫卵携带细菌的分离及其16S rDNA测序鉴定  83
    4.2.3 实验设计  83-85
      4.2.3.1 正常和无菌水虻幼虫获得方法  83-84
      4.2.3.2 水虻幼虫生长发育特性对比测试  84-85
    4.2.4 水虻未成熟期生活史特性测定  85
    4.2.5 水虻成虫生活史特性测定  85
    4.2.6 数据处理  85-86
  4.3 结果与分析  86-91
    4.3.1 水虻虫卵细菌分离鉴定  86
    4.3.2 未成熟期水虻生活史特性  86-88
      4.3.2.1 幼虫存活预蛹率  86-87
      4.3.2.2 幼虫发育历期  87
      4.3.2.3 预蛹重量  87
      4.3.2.4 蛹历期  87-88
    4.3.3 水虻成虫生活史特性  88-91
      4.3.3.1 幼虫存活到成虫阶段比率  88
      4.3.3.2 成虫重量  88-91
      4.3.3.3 成虫寿命  91
  4.4 讨论  91-92
  4.5 主要结论  92-94
第五章亮斑扁角水虻虫体脂肪成分作为新型生物能源材料  94-103
  5.1 前言  94-96
  5.2 材料与方法  96-98
    5.2.1 水虻种群  96
    5.2.2 回收油脂后的固态餐厨剩余物(SRF)  96
    5.2.3 SRF生物转化获得昆虫生物质  96-97
    5.2.4 水虻粗油脂提取  97
    5.2.5 生物柴油生产  97
    5.2.6 分析测定方法  97-98
  5.3 结果与讨论  98-102
    5.3.1 固态餐厨剩余物(SRF)转化生产水虻幼虫生物质  98-99
    5.3.2 水虻粗油脂提取  99-100
    5.3.3 生物柴油生产  100
    5.3.4 水虻基生物柴油化学组成分析  100-101
    5.3.5 水虻基生物柴油特性  101-102
  5.4 结论  102-103
第六章总结与展望  103-105
参考文献  105-123
在读期间发表与待发表论文  123-125
致谢  125

卵携带的微生物对亮斑扁角水虻产卵行为和生长发育的影响

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