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慢病毒介导转基因小鼠胚胎的初步研究

作　者: 陈维
导　师: 周锐
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 慢病毒共感染超数排卵胚胎体外培养胚胎移植
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

转基因动物模型已成为生命科学和医学领域中用于研究基因的结构与功能、基因治疗、器官移植、建立疾病的动物模型和畜牧业中用于改善动物的生产性能等方面最理想的试验材料,它是联系分子、细胞水平和活体动物水平研究的桥梁。用于转基因动物制备的方法有很多种,如：DNA原核显微注射法、逆转录病毒介导法、胚胎干细胞法、体细胞核移植法和精子载体法等,慢病毒感染转法是目前最为普遍的转基因动物制备的方法之一。到目前为止,慢病毒感染法已成功制备出了转基因大小鼠,大型哺乳动物如牛、羊和猪以及家禽等,且获得转基因动物的效率较传统方法高出许多。小鼠因其独特的生理和遗传特性,已成为生命科学领域中进行基因功能研究、发育生物学研究、疾病动物模型等最理想的模式动物。本研究在构建PBD2转基因小鼠模型的过程中,初步探索了昆明小鼠的超数排卵条件、小鼠胚胎的拾取方法、胚胎体外培养条件和慢病毒与胚胎共培养的存活率分析等方面；通过对这些条件的摸索,然后建立慢病毒感染法制备转基因小鼠的平台,为今后建立转基因小鼠模型,进而研究基因功能和研究动物疾病发病机制等方面奠定基础。现将主要研究的结果报告如下：1.复制缺陷型慢病毒的包装本研究所用的是第四代慢病毒载体系统,一个骨架质粒和三个包装质粒构成。根据本实验室已经构建好的pCA-PBD2载体,我们将PBD2序列和pCA载体上的chickenβ-actin promoter(CBAP)真核表达强启动子序列、chickenβ-actin intron (CBAI)和rabbitβ-globin intron (RBAI)内含子序列一起连入慢病毒骨架载体,构建重组质粒。然后共转染293ft细胞,包装高滴度的复制缺陷性的重组慢病毒。本研究包装浓缩慢病毒滴度达7.2×106TU/ml,体外感染无透明带胚胎实验结果显示,病毒滴度达到在104TU/ml时,感染率100%。在慢病毒滴度为104 TU/ml时,本研究比较分析了慢病毒与各个阶段胚胎共培养后的感染存活率,1-细胞、2-细胞和4-细胞阶段的胚胎可以在与慢病毒共培养8h以内,进行输卵管移植,8-细胞阶段的胚胎在感染后8-12h内立即进行子宫移植,这些条件为慢病毒感染法制备转基因小鼠提供了新的思路。2.小鼠超排和胚胎的体外培养动物早期胚胎的体外培养是慢病毒与胚胎共感染法制备转基因动物的关键环节。超数排卵对小鼠胚胎的获取起着决定性的作用,本研究通过对注射激素的不同剂量和两种激素注射的不同时间间隔进行比较,结果显示10IU/只是本研究所用实验小鼠的最佳剂量,注射激素的时间间隔为48h；通过对取胚方法的比较发现,用子宫冲胚与体外培养相结合的方法,所获得8-细胞及桑葚胚胚胎要优于子宫冲胚和体外培养。现阶段,常用的胚胎培养液种类很多,本研究选择了M16和KSOM培养液进行胚胎的体外培养比较,结果表明,两种培养液进行胚胎的体外短期培养效果不明显。在培养方法方面,本研究比较了微滴培养法和开放式培养两种方法对8-细胞和桑葚胚胚胎发生率以及体外培养48h的胚胎死亡率,结果显示,微滴培养法在胚胎体外短期培养要优于开放式培养。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略语表  12-14
1 文献综述  14-28
  1.1 哺乳动物胚胎形态发生的机制  14-17
    1.1.1 哺乳动物胚体的形成  14-15
    1.1.2 哺乳动物早期胚胎体内发育的基本过程  15-17
  1.2 小鼠早期胚胎的获取与体外培养  17-21
    1.2.1 小鼠受精的基本过程  17
    1.2.2 小鼠超数排卵的机理  17-18
    1.2.3 影响小鼠超数排卵的因素  18
    1.2.4 小鼠早期胚胎体外发育的条件及影响胚胎发育的若干因素  18-20
    1.2.5 小鼠早期胚胎的体外培养系统  20-21
  1.3 慢病毒载体法制备转基因动物  21-26
    1.3.1 常规转基因动物技术  21-23
    1.3.2 慢病毒载体系统的发展历史  23-25
    1.3.3 慢病毒介导法制备转基因动物的基本原理  25-26
    1.3.4 慢病毒介导法制备转基因动物的优势  26
  1.4 慢病毒与无透明带小鼠胚胎的体外共培养  26-27
    1.4.1 透明带对小鼠胚胎的作用  26
    1.4.2 慢病毒与小鼠胚胎共培养的实验依据  26-27
  1.5 小鼠胚胎移植技术  27-28
    1.5.1 胚胎移植技术的基本原理  27-28
    1.5.2 胚胎移植技术的发展历史及进展  28
2 研究目的及意义  28-29
3 实验材料及方法  29-44
  3.1 实验材料  29-34
    3.1.1 细胞、菌株及培养基  29
    3.1.2 实验试剂及配制  29-30
    3.1.3 实验相关质粒  30-32
    3.1.4 常用分子生物学试剂及配制  32-33
    3.1.5 实验相关试剂盒  33
    3.1.6 实验仪器与器皿  33
    3.1.7 试验动物及手术器械  33-34
    3.1.8 其他材料  34
  3.2 实验方法  34-44
    3.2.1 293ft细胞的复苏与培养  34-35
    3.2.2 重组载体构建  35-38
    3.2.3 重组慢病毒的包装过程  38-39
    3.2.4 重组慢病毒的浓缩  39
    3.2.5 重组慢病毒滴度测定  39-40
    3.2.6 受供体母鼠及结扎公鼠的准备  40
    3.2.7 小鼠超数排卵  40-41
    3.2.8 小鼠各阶段胚胎的获取  41
    3.2.9 小鼠胚胎透明带的去除  41-42
    3.2.10 小鼠胚胎的体外培养方法及与慢病毒共感染  42-43
    3.2.11 小鼠胚胎的异体移植技术  43
    3.2.12 数据处理  43-44
4 结果与分析  44-54
  4.1 重组慢病毒的构建与鉴定  44-46
    4.1.1 pCABD2和pLenti-CABD2重组载体的酶切鉴定  44
    4.1.2 重组慢病毒的包装与滴度测定  44-46
  4.2 小鼠超排与胚胎的体外培养  46-49
    4.2.1 小鼠胚胎的超数排卵分析  46-47
    4.2.2 小鼠各阶段胚胎的体外培养条件及问题分析  47-49
  4.3 小鼠各阶段胚胎与慢病毒共感染  49-53
    4.3.1 胚胎体外培养方法比较结果分析  49-50
    4.3.2 不同滴度慢病毒感染胚胎分析  50-52
    4.3.3 慢病毒感染各阶段胚胎情况  52-53
    4.3.4 慢病毒感染各阶段无透明带胚胎存活率分析  53
  4.4 小鼠无透明带胚胎的异体移植结果分析  53-54
5 讨论  54-57
  5.1 影响慢病毒滴度的因素分析  54-55
  5.2 小鼠超数排卵及胚胎体外培养影响因素分析  55-56
  5.3 感染胚胎的筛选与移植分析  56-57
6 结论  57-58
参考文献  58-68
致谢  68

慢病毒介导转基因小鼠胚胎的初步研究

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