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红景天中苷（苷元）类成分的抗辐射活性及其在Caco-2模型中的转运机制研究

作　者: 马天翔
导　师: 吴久鸿
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物化学
关键词: 红景天 抗辐射 抗氧化 Caco-2单层模型
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


随着我国“神州”载人航天飞行的圆满成功，目前载人航天已成为我国一项重大的系统工程，被列入国家的经济建设计划中。在长期航天飞行中，空间辐射是危害宇航员健康的主要因素之一。提高航天员对空间特殊环境的适应能力和耐受能力，有效保障航天员健康是确保航天任务圆满完成的重要前提。景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola L.）植物为多年生草本或亚灌木植物，已有研究证明其具有明显的抗辐射、抗氧化和调节免疫等作用。但目前对红景天的研究仅限于对其粗提物或红景天苷的研究，对于其它活性成分的作用以及可能的机制则尚无系统的研究报道。苯乙素糖苷-红景天苷（苷元为酪醇）和苯丙素糖苷-洛塞琳、络萨维（苷元为肉桂醇）是红景天属植物的两类主要活性成分，具有独特的药理功能，因而成为近年来红景天活性研究的热点。本研究针对红景天中苷（苷元）类成分，从辐射防护的抗氧化机制和免疫保护作用两个角度切入，通过建立体外抗氧化模型和辐射所致的淋巴细胞损伤模型，对红景天中苷（苷元）类成分进行辐射防护活性评价，筛选得到抗辐射活性成分。基于筛选评价的结果，通过Caco-2单层细胞体外渗透转运模型对目标抗辐射活性成分的口服吸收情况进行预测，对其转运机制及影响因素进行初步探讨，评估其作为辐射防护剂的可行性，为进一步深入了解其在体内的口服吸收情况以及生物利用度等问题提供实验依据，为下一步开发高效、低毒的辐射防护剂提供基础研究资料，为潜在辐射防护剂的研发和利用奠定实验基础。本研究主要围绕以下三方面内容展开：（一）从辐射防护的抗氧化机理出发，利用自由基清除原理建立并优化六种体外抗氧化模型，系统地对红景天中苷（苷元）类成分的抗氧化活性进行评价。辐射生物学效应产生的最根本原因，是由于射线作用于机体导致的生物分子电离和激发的直接作用，以及由此产生超氧阴离子，羟自由基等活性氧（Reactiveoxygen species，ROS）导致的继发作用，如核酸分子、蛋白质分子以及生物膜的损伤等。因此，清除已经形成的ROS或者抑制其产生，是辐射防护的主要途径之一。本研究建立并优化了DPPH自由基、NBT-NADH-PMS体系、羟自由基、氮氧自由基（NO）、脂质过氧化反应体系和铁离子抗氧化体系六种抗氧化模型，分别测定了芦丁苷、红景天苷、异槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷、络萨维和肉桂醇对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基和NO自由基四种自由基的清除能力，以及对脂质过氧化的抑制能力和总抗氧化能力。结果表明，红景天中的苷（苷元）类化学成分从不同方面表现出抗氧化活性：红景天苷、酪醇、洛塞琳、络萨维和肉桂醇表现出较强的羟自由基清除能力(IC50分别为18.97μg·mL-1，10.84μg·mL-1，61.84μg·mL-1，81.08μg·mL-1，26.00μg·mL-1)。芦丁苷和异槲皮苷表现出较强的DPPH自由基和超氧阴离子清除能力，抗脂质过氧化和总抗氧化能力；熊果苷的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力较强。（二）从辐射防护剂的免疫保护作用出发，利用细胞学和分子生物学实验方法建立体外辐射防护模型，在细胞水平上对红景天中苷（苷元）类化合物的体外抗辐射活性进行评价。免疫系统是辐射损伤的重要靶器官，具有高度的辐射敏感性。淋巴细胞损伤是辐射导致机体免疫功能抑制的重要原因，因此有效地保护淋巴细胞免受辐射损伤对降低机体辐射损伤有重要意义。本研究先通过细胞增殖检测方法比较，细胞辐射敏感性研究，增殖与辐照的量效关系考察等方面，对建立体外辐射防护模型进行了方法学评价；又在确保受试物对细胞无毒的基础上，通过给予人淋巴母细胞（AHH-1）10Gy60Co-γ射线一次性照射建立辐射损伤模型，以MTS法检测红景天苷、芦丁苷、异槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷和络萨维对受到辐射后AHH-1细胞的保护作用。研究结果显示，与模型组比较，异槲皮苷(12.5μg.mL-1，P <0.05)、红景天苷(12.5μg.mL-1，P <0.05)、酪醇(50μg.mL-1，P <0.05)、洛塞琳(25μg.mL-1，P <0.05)、络萨维(12.5μg.mL-1，P <0.01)和熊果苷(12.5μg.mL-1，P <0.01)均能够显著提高辐射损伤AHH-1的增殖活性。基于抗氧化与免疫保护两部分实验结果，确定了红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维为目标抗辐射活性成分，进行下一步的渗透转运研究。（三）建立用于药物吸收研究Caco-2渗透转运模型，评价目标抗辐射活性成分的口服吸收情况，初步探讨其转运机制。通过观察细胞单层形态，监测跨膜电阻（TEER）值的变化以及比较普萘洛尔和阿替洛尔两种标记物在单层模型的转运特性等指标对Caco-2细胞单层模型的可靠性进行评价。结果显示，TEER值在Caco-2细胞单层形成过程中稳定上升，达到实验模型要求标准（>500Ω·cm2）。胞内转运标记物普萘洛尔(高渗透性药物，表观渗透系数（Papp）=1.01×10-5cm·s-1)和胞间转运标记物阿替洛尔(低渗透性药物，Papp=2.20×10-7cm·s-1)呈现可预见的高、低Papp值，表明建立的Caco-2细胞模型在完整性、通透性等方面均符合小肠吸收机制研究的要求。结合抗氧化与体外AHH-1模型两部分实验结果，选定抗氧化作用和保护60Co-γ射线辐照后AHH-1细胞两方面作用均较强的红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维为目标抗辐射活性成分，通过体外Caco-2渗透转运模型对这四个成分的肠毒性、吸收情况及转运机制进行研究。本研究通过考察抗辐射活性成分对Caco-2细胞24h的细胞毒性作用，对目标成分的肠毒性进行评估，并推算其用于转运模型的安全剂量；在建立了可靠的转运模型和确保受试物对Caco-2细胞单层无显著毒性的前提下，应用Caco-2单层模型对受试物进行了双向转运研究（肠腔侧向肠壁侧，AP→BL；肠壁侧向肠腔侧，BL→AP），考察了转运时间（60min-180min）和药物浓度（50μM-200μM）对转运的影响。然后，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定并计算受试物在渗透转运模型中的Papp。AP→BL转运数据表明，红景天苷(Papp=0.85±0.12×10-6cm·s-1)、洛塞琳(Papp=0.61±0.10×10-6cm·s-1)和络萨维(Papp=0.74±0.12×10-6cm·s-1)均为难吸收(PappAP→BL<1×10-6cm·s-1)药物。红景天苷的苷元酪醇(Papp=1.52±0.16×10-6cm·s-1)渗透性要好于红景天苷。浓度为200μM时辐射防护活性成分的双向转运数据未表现出明显方向性(0.61×10-6cm·s-1<PappBL→AP/PappAP→BL<1.52×10-6cm·s-1)，且转运随药物浓度、作用时间呈依赖性动态变化，提示红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维主要转运方式为被动转运。此外，红景天苷BL向AP方向转运大于AP向BL方向，提示其转运过程可能存在外排现象，这也可能是造成其吸收性较差的原因。综上所述，红景天中的苷（苷元）类化学成分从不同方面均表现出一定的抗氧化活性。其中，红景天苷、酪醇、洛塞琳、络萨维和肉桂醇表现出较强的羟自由基清除能力。在淋巴细胞损伤模型中，异槲皮苷、红景天苷、络萨维、洛塞琳、熊果苷和酪醇均能够显著提高辐射损伤的AHH-1细胞的活力。两部分筛选结果提示红景天苷、酪醇、洛塞琳和络萨维可能为红景天中的抗辐射活性成分。在Caco-2单层模型中的转运研究中发现，红景天苷、洛塞琳和络萨维均为难吸收药物；而作为红景天苷的苷元-酪醇，其吸收性优于红景天苷。

全文目录


英文缩略词表  8-10
中文摘要  10-13
Abstract  13-16
前言  16-30
  1 红景天属植物简介  16-20
    1.1 红景天属植物的化学成分  16
    1.2 红景天属植物药理活性及作用机制  16-20
      1.2.1 “适应原”与减压作用  17-18
      1.2.2 抗缺氧  18
      1.2.3 抗疲劳  18
      1.2.4 抗病毒及抗肿瘤  18-19
      1.2.5 改善骨新陈代谢  19
      1.2.6 免疫增强作用  19
      1.2.7 心血管及神经保护作用  19-20
      1.2.8 抗辐射作用  20
      1.2.9 其他作用  20
  2 红景天在与课题相关领域的国内外研究现状  20-23
    2.1 抗氧化作用研究现状  20-22
      2.1.1 抗氧化作用机制  21
      2.1.2 天然产物抗氧化作用的途径  21-22
      2.1.3 红景天抗氧化作用研究现状  22
    2.2 基于 Caco-2 体外模型的渗透转运研究现状  22-23
  3 立题依据及本研究的意义  23-25
  4 参考文献  25-30
第一部分 红景天中八种苷（苷元）体外抗氧化作用的研究  30-105
  第一节 受试物对 DPPH 自由基清除作用  30-39
    1 实验材料  30-31
      1.1 实验仪器  30
      1.2 实验试剂  30
      1.3 溶液配制  30-31
    2 实验方法  31-32
    3 实验结果  32-38
    4 讨论  38-39
  第二节 受试物对超氧阴离子清除作用  39-51
    1 实验材料  39-40
      1.1 实验仪器  39
      1.2 实验试剂  39
      1.3 溶液配制  39-40
    2 实验方法  40-41
    3 实验结果  41-50
    4 讨论  50-51
  第三节 受试物对羟自由基清除作用  51-65
    1 实验材料  51-52
      1.1 实验仪器  51
      1.2 实验试剂  51
      1.3 溶液配制  51-52
    2 实验方法  52-54
      2.1 乙醇对羟自由基的清除作用考察  52-53
      2.2 实验条件的优化  53-54
    3 实验结果  54-64
      3.1 模型条件评价  54-55
      3.2 DMSO 的羟自由基清除活性  55-56
      3.3 抗氧剂和萃取步骤对实验结果的影响  56-57
      3.4 受试物浓度选择  57-59
      3.5 受试物对羟自由基清除作用的考察  59-64
    4 讨论  64-65
  第四节 受试物对 NO 自由基抑制作用  65-73
    1 实验材料  65-66
      1.1 实验仪器  65
      1.2 实验试剂  65
      1.3 溶液配制  65-66
    2 实验方法  66-67
      2.1 实验模型的建立及条件优化  66-67
      2.2 Griess 反应评价受试物对 NO 自由基的抑制作用  67
    3 实验结果  67-72
      3.1 SNP 的最佳剂量确定  67-68
      3.2 红景天中八种苷（苷元）对 NO 抑制作用的比较  68-72
    4 讨论  72-73
  第五节 受试物总抗氧化能力的考察  73-83
    1 实验材料  73-74
      1.1 实验仪器  73
      1.2 实验试剂  73
      1.3 溶液配制  73-74
    2 实验方法  74-75
      2.1 建立 FeSO_4标准曲线  74
      2.2 TPTZ 法评价总抗氧化能力  74-75
    3 实验结果  75-82
      3.1 FeSO_4标准曲线  75-76
      3.2 红景天中八种苷（苷元）的总抗氧化能力比较  76-82
    4 讨论  82-83
  第六节 受试物抗脂质过氧化能力的考察  83-101
    1 实验材料  83-85
      1.1 实验仪器  83
      1.2 实验试剂  83
      1.3 实验动物  83
      1.4 溶液配制  83-85
    2 实验方法  85-87
      2.1 脂质过氧化模型的建立  85-87
        2.1.1 制备小鼠肝匀浆  85
        2.1.2 建立 MDA（丙二醛）标准曲线  85
        2.1.3 模型的验证  85-86
        2.1.4 实验条件的优化  86-87
      2.2 脂质过氧化模型的建立  87
    3 实验结果  87-100
      3.1 MDA（丙二醛）标准曲线  87-88
      3.2 FeSO_4和 BHT 对实验结果的影响  88-89
      3.3 不同肝匀浆浓度对实验结果的影响  89-91
      3.4 红景天中八种苷（苷元）的抗脂质过氧化能力比较  91-100
    4 讨论  100-101
  小结  101-102
  参考文献  102-105
第二部分 红景天中八种苷（苷元）抗辐射作用的体外研究  105-132
  1 实验材料  105-107
    1.1 实验仪器  105
    1.2 实验试剂  105
    1.3 细胞株与培养条件  105-106
    1.4 辐射源  106
    1.5 溶液配制  106-107
  2 实验方法  107-109
    2.1 辐射损伤模型的构建  107-108
      2.1.1 细胞增殖检测方法的考察  107
      2.1.2 细胞种类的选择  107
      2.1.3 细胞密度及检测时间的考察  107
      2.1.4 辐照剂量的选择  107-108
    2.2 MTS 法考察受试物对 AHH-1 细胞的毒性作用  108
    2.3 ~(60)Co-γ辐照后测定受试物对 AHH-1 细胞的保护作用  108
    2.4 统计学分析  108-109
  3 实验结果  109-130
    3.1 MTS 法与 MTT 法的比较  109-110
    3.2 AHH-1 细胞与 HUVEC 细胞对γ射线敏感性的对比结果  110-111
    3.3 最佳 AHH-1 细胞密度  111-112
    3.4 最佳辐照剂量  112-113
    3.5 红景天中八种苷（苷元）对 AHH-1 细胞的毒性作用  113-122
    3.6 目标受试物对辐照后 AHH-1 细胞的保护作用  122-130
  4 讨论  130-131
  参考文献  131-132
第三部分 目标抗辐射活性成分在 Caco-2 模型上的渗透及转运机制研究  132-155
  第一节 Caco-2 渗透模型的构建与评估  132-143
    1 实验材料  132-134
      1.1 实验仪器  132-133
      1.2 实验试剂  133
      1.3 细胞株  133
      1.4 溶液配制  133-134
    2 实验方法  134-137
      2.1 Caco-2 单层细胞渗透转运模型的建立  134-135
        2.1.1 Transwell 培养板的胶原包被  134
        2.1.2 Caco-2 细胞的培养  134
        2.1.3 Caco-2 细胞的接种  134-135
      2.2 不同转运介质及不同作用时间的考察  135
      2.3 Caco-2 单层细胞渗透转运模型的评价  135-136
        2.3.1 细胞单层的完整性和紧密性评价  135-136
        2.3.2 细胞单层的通透性验证  136
      2.4 表观通透系数计算  136-137
    3 实验结果  137-143
      3.1 Caco-2 单层模型的形态学确证  137-138
      3.2 转运介质及作用时间对 TEER 的影响  138-139
      3.3 细胞单层的完整性和紧密性验证  139-140
      3.4 细胞单层的通透性验证  140-143
  第二节 目标抗辐射活性成分对细胞单层毒性的考察及供侧浓度的确立  143-148
    1 实验材料  143
      1.1 实验仪器  143
      1.2 实验材料  143
    2 实验方法  143-144
    3 实验结果  144-148
  第三节 目标抗辐射活性成分的双向转运研究  148-153
    1 实验材料  148
      1.1 实验仪器  148
      1.2 实验材料  148
    2 实验方法  148-149
      2.1 具体实验步骤  148
      2.2 数据分析与处理  148-149
    3 实验结果  149-153
      3.1 目标抗辐射活性成分在 Caco-2 单层模型中的双向转运  149-150
      3.2 药物浓度对转运的影响  150-152
        3.2.1 AP→BL 方向  150-151
        3.2.2 BL→AP 方向  151-152
      3.3 时间对转运的影响  152-153
  讨论  153-154
  参考文献  154-155
结语  155-157
综述  157-177
  摘要  157-158
  1 Caco-2 单层细胞模型  158-159
    1.1 模型的优点与局限性  158
    1.2 模型表达的载体  158-159
  2 渗透和转运的研究  159-167
    2.1 药物的通透性评价  160-161
    2.2 摄取研究  161-162
    2.3 外排研究  162-164
    2.4 基因敲除模型  164-165
    2.5 协同作用研究  165-166
    2.6 药物相互作用研究  166-167
    2.7 其它应用（计算机辅助模型）  167
  3 小结与展望  167-169
  参考文献  169-177
个人简历  177
在读期间发表论文  177-178
致谢  178-179
附件  179-183

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