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氯和二氧化氯对人轮状病毒的消毒规律及基因组损伤作用研究

作　者: 薛斌
导　师: 李君文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: HRV 氯 二氧化氯 灭活 感染性 基因损伤 RT-PCR 荧光定量RT-PCR
分类号: R123.6
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：轮状病毒现已成为引发全球婴幼儿急性腹泻的主要病原体，介水传播的轮状病毒正成为日益突出的公共卫生难题。饮水消毒是水处理工艺的重要组成部分，在抵御介水传播疾病的发生方面具有重要意义。然而，迄今为止仍鲜见关于常用消毒剂（如氯和二氧化氯）对人轮状病毒（Human Rotavirus，HRV）作用效果的报导，并且由于以往研究中的实验条件（如温度、pH、病毒自身状态及消毒效果评价方法）差异较大，所得出的结论不统一。此外，在现行的检测方法也存在很大不足：一方面传统的细胞培养法存在操作复杂、耗时长等缺点；另一方面，新兴的PCR方法虽然快速、灵敏度高、特异性强，但仅能对病毒核酸进行检测，很难反映病毒的感染性，因而可能导致假阴性或假阳性的结果，目前被一致认为不能单独用于病毒的消毒效果评价。然而事实上，在以往的大多数研究中，研究者们往往忽略了病毒基因组的不同区域对消毒剂抵抗力可能不同这一重要事实，仅对病毒的某个基因片段进行PCR检测，再用该部分的结果来反映消毒剂对病毒全基因组的影响，采用部分代替整体，因而结论不可靠。本研究分别采用E.coli25922和MS2噬菌体作为水中肠道细菌和肠道病毒的指示微生物，在同条件下系统地比较了氯和二氧化氯对E.coli25922、MS2噬菌体和HRV的消毒效果。此外，我们通过设计多对引物，实现了HRV全基因组的扩增，并且首次在基因全长范围内观察了氯和二氧化氯对HRV的基因损伤情况。最后，在观测到消毒剂作用HRV敏感位点的基础上，建立荧光定量RT-PCR新方法。将该方法与传统的细胞培养法同时进行HRV消毒效果评价，并进行两种评价方法的相关性比较。本研究的主要目的：(i)同条件下系统评价比较氯和二氧化氯对E.coli25922、MS2噬菌体和HRV的作用效果；(ii)观察经氯和二氧化氯消毒后HRV的基因损伤及其与感染性之间的关系；(iii)基于敏感位点，建立可区分HRV感染性的荧光定量RT-PCR新方法，用于消毒后HRV的消毒效果评价。方法：1.采用滤膜法对处理前后的E.coli25922进行计数，双层平板法观察MS2噬菌体的空斑数，TCID50方法计算HRV滴度。所有的消毒实验（氯和二氧化氯）均于20°C恒温条件下、ODF缓冲液（pH7.2）中进行。每个条件下设置三次独立重复实验，每组两个平行，同时进行各时间点上微生物的计数和剩余消毒剂浓度测定。采用一级动力学模型对消毒剂的衰减情况进行拟合，采用EFH模型对各条件下微生物的灭活情况进行消毒动力学分析。2.根据HRV WA株各基因片段在NCBI基因库内的参考序列，采用Oligo v7.0软件设计引物16对，对HRV的11个RNA片段分段进行扩增。所有引物均用病毒阳性样本进行确证，并进行灵敏度测试。对于消毒前后的同一样本，同时采用细胞培养法进行感染性分析和RT-PCR方法进行基因组扩增。观察经不同剂量的消毒剂（氯:0.2、0.4、0.6mg/L；二氧化氯:0.05、0.1、0.2mg/L）处理后，各时间点上HRV分别达到约1-、2-、3-、4-或>5-个杀灭对数值时的基因损伤情况。此外，我们设置了1.2mg/L氯消毒组和0.5mg/L二氧化氯消毒组，来观察HRV完全失活时的基因损伤情况。3.采用Oligo v7.0软件设计4对引物，对氯作用HRV基因组的敏感位点VP4（1227-2354bp）片段进一步细分。采用SYBR Green染料法进行荧光定量RT-PCR反应，构建质粒标准品并绘制标准曲线。采用HRV阳性样本探讨细胞培养与荧光定量RT-PCR两种检测方法的相关性。采用0.6mg/L氯进行消毒实验，并对于消毒后的同一样本同时采用细胞培养和荧光定量RT-PCR两种方法进行消毒效果评价。结果：1.氯和二氧化氯对E.coli25922、MS2噬菌体和HRV的消毒效果：在本研究条件下，氯和二氧化氯对三种微生物的杀灭效果均随消毒剂量的增加而加强，且均呈现非线性的灭活曲线。经EFH模型推算得出，氯灭活4个对数值的E.coli25922、MS2噬菌体和HRV所需Ct值分别为0.61~0.71、2.06~3.19和5.55~5.59mg/L min；二氧化氯灭活4个对数值的E.coli25922、MS2噬菌体和HRV所需的Ct值分别为0.37~0.72、0.83~0.95和1.21~2.47mg/L min。2.氯和二氧化氯消毒后HRV的基因损伤情况及其与感染性的关系：引物3、6所扩增的基因片段VP1（2012-3302bp）和VP3（21-1656bp）对氯的抵抗力最弱。引物9和12所扩增的VP4（1227-2354bp）和NSP1（8-1523bp）的敏感性次之。引物1、8、10、11和13所扩增的VP1（15-1376bp），VP4（4-1260bp），VP6（1-1356bp），VP7（7-1062bp）和NSP2（4-1043bp）基因片段对在HRV完全失活时仍有扩增。而氯对引物9所对应的VP4（1227-2354bp）基因片段的损伤与感染性消失相一致。对二氧化氯来说，VP3（21-1656bp）和NSP1（8-1523bp）的抵抗力最弱，引物7所对应的VP3（1215-2569bp）敏感性次之。引物1、2、3、4、5、8、9、10、11、13、14、15和16所对应的VP1（15-3302bp）、VP2（4-2702bp）、VP4（4-2354bp）、VP6（1-1356bp）、VP7（7-1062bp）、NSP2（4-1043bp）、NSP3（1-1050bp）、NSP4（6-748bp）和NSP5（20-664bp）基因片段在HRV完全失活时仍有扩增。3.荧光定量RT-PCR方法用于氯消毒效果评价：基于敏感位点所建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。对0.6mg/L氯消毒后的HRV同时采用细胞培养和荧光定量RT-PCR方法进行消毒效果评价，结果发现，两种方法呈现出良好的相关性。并且，当氯作用20min后，此时反应体系中存活的HRV低于TCID50方法的检出限，因而无法用细胞培养法对其定量。而荧光定量RT-PCR方法最低能检测到滴度为100.12TCID50/ml的HRV，因而灵敏度更高，检测范围更广。这就为氯消毒后水环境中感染性HRV的快速、准确评价提供了新的技术手段。结论：二氧化氯对E.coli25922、MS2噬菌体和HRV的消毒效果均优于氯。E.coli25922对氯和二氧化氯的抵抗力最弱，MS2噬菌体次之，HRV最强。现行的氯消毒方法在有效预防和控制HRV介水传播方面可能存在不足。氯对HRV基因片段VP4（1227-2354bp）的损伤与感染性消失相一致。二氧化氯对HRV的基因损伤与感染性无关。基于敏感位点建立的荧光定量RT-PCR方法可用于氯对HRV消毒效果评价。

全文目录


缩略词表  7-8
摘要  8-11
Abstract  11-15
第一章 前言  15-28
  1 水环境中的轮状病毒及其危害  15-17
    1.1 轮状病毒简介  15
    1.2 轮状病毒的危害  15-16
    1.3 轮状病毒的传播方式  16-17
    1.4 水环境中的轮状病毒  17
  2 常见饮水消毒技术简介  17-21
    2.1 氯消毒法  17-18
    2.2 二氧化氯消毒法  18
    2.3 臭氧消毒法  18-19
    2.4 紫外线消毒法  19
    2.5 氯胺消毒法  19-20
    2.6 联合消毒法  20-21
  3 消毒剂灭活病毒效果评价方法的研究进展  21-26
    3.1 细胞培养法  21
    3.2 免疫学方法  21-22
    3.3 分子生物学方法  22-25
    3.4 细胞培养联合PCR法  25
    3.5 蛋白酶、核酸酶PCR前处理法  25-26
    3.6 免疫捕获、细胞受体联合PCR法  26
  4 课题的提出  26-27
  5 本研究的目的和意义  27-28
第二章 氯和二氧化氯对水中人轮状病毒消毒效果研究  28-51
  1 引言  28-29
  2 实验材料与方法  29-36
    2.1 实验材料  29-32
      2.1.1 研究对象  29
      2.1.2 仪器设备  29-30
      2.1.3 材料和试剂  30-31
      2.1.4 主要试剂、培养基及溶液配制  31-32
    2.2 实验方法  32-36
      2.2.1 微生物悬液制备  32-33
      2.2.2 消毒剂制备及浓度测定  33
      2.2.3 无氯耗的水、缓冲液及容器的制备  33
      2.2.4 消毒实验  33-34
      2.2.5 微生物的测定方法  34-35
      2.2.6 数据处理方法  35-36
  3 结果  36-49
    3.1 氯和二氧化氯对水中E.coli 25922的消毒效果  36-40
      3.1.1 E.coli 25922消毒过程中氯和二氧化氯衰减情况  36
      3.1.2 氯和二氧化氯灭活E.coli 25922的表观动力学  36
      附图表  36-40
    3.2 氯和二氧化氯对MS2噬菌体的消毒效果  40-44
      3.2.1 MS2噬菌体消毒过程中氯和二氧化氯的衰减情况  40
      3.2.2 氯和二氧化氯灭活水中MS2噬菌体的表观动力学  40
      附图表  40-44
    3.3 氯和二氧化氯对HRV消毒效果  44-47
      3.3.1 HRV消毒过程中氯和二氧化氯的衰减情况  44
      3.3.2 氯和二氧化氯灭活水中HRV的表观动力学  44-45
      附图表  45-47
    3.4 氯和二氧化氯对三种微生物杀灭效果的比较  47-49
  4 讨论  49-51
第三章 氯和二氧化氯对人轮状病毒全基因组损伤情况  51-70
  1 引言  51-52
  2 实验材料与方法  52-58
    2.1 实验材料  52-54
      2.1.1 研究对象  52
      2.1.2 仪器设备  52-53
      2.1.3 材料和试剂  53
      2.1.4 主要试剂、培养基及溶液配制  53-54
    2.2 实验方法  54-58
      2.2.1 HRV悬液制备  54
      2.2.2 消毒剂制备及浓度测定  54
      2.2.3 无氯耗的水、缓冲液及容器的制备  54
      2.2.4 消毒实验  54
      2.2.5 HRV滴度测定  54
      2.2.6 消毒效果评价  54
      2.2.7 引物设计  54-56
      2.2.8 RNase清除剂用于RNA的前处理  56
      2.2.9 提取RNA  56-57
      2.2.10 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）  57-58
      2.2.11 RT-PCR反应的灵敏度  58
  3 结果  58-68
    3.1 灵敏度实验  58
    3.2 氯和二氧化氯对HRV的作用效果  58-60
    3.3 氯和二氧化氯对HRV的基因损伤  60-66
    3.4 氯和二氧化氯对HRV基因损伤与感染性的关系  66-68
  4 讨论  68-70
第四章 荧光定量RT-PCR对氯灭活水中人轮状病毒效果评价  70-93
  1 引言  70-71
  2 实验材料与方法  71-81
    2.1 实验材料  71-74
      2.1.1 研究对象  71
      2.1.2 仪器设备  71-72
      2.1.3 材料和试剂  72-73
      2.1.4 主要试剂、培养基及溶液配制  73-74
    2.2 实验方法  74-81
      2.2.1 HRV悬液制备  74
      2.2.2 消毒剂制备及浓度测定  74
      2.2.3 无氯耗的水、缓冲液及容器的制备  74
      2.2.4 消毒实验  74
      2.2.5 HRV滴度测定  74
      2.2.6 RNase清除剂用于RNA的前处理  74
      2.2.7 提取RNA  74
      2.2.8 制备cDNA标准品  74-79
      2.2.9 以重组质粒为标准品绘制标准曲线  79-80
      2.2.10 TCID50与qRT-PCR拷贝数浓度之间的相关性  80
      2.2.11 qRT-PCR用于HRV消毒效果评价  80
      2.2.12 数据分析  80-81
  3 结果  81-91
    3.1 病毒RNA纯度及含量测定  81
    3.2 PCR产物胶回收结果  81-82
    3.3 蓝白斑阳性克隆筛选  82
    3.4 质粒提取、鉴定及含量测定  82-83
      3.4.1 质粒提取、鉴定  82
      3.4.2 质粒含量测定  82-83
    3.5 轮状病毒标准品扩增  83-86
      3.5.1 荧光定量标准曲线的绘制  83-85
      3.5.2 荧光定量体系的特异性  85
      3.5.3 荧光定量体系的稳定性与重复性  85
      3.5.4 荧光定量体系的灵敏度与检测限  85-86
    3.6 TCID50与qRT-PCR拷贝数浓度之间的相关性  86-87
    3.7 qRT-PCR用于氯对HRV消毒效果评价  87-91
      3.7.1 氯对HRV的消毒效果  87-90
      3.7.2 qRT-PCR与细胞法对氯灭活水中HRV效果评价相关性  90-91
  4 讨论  91-93
第五章 结论  93-94
参考文献  94-111
文献综述  111-119
  参考文献  115-119
个人简介  119-120
致谢  120-121

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 环境卫生、环境医学 > 水与给水卫生 > 给水卫生 > 水的净化与消毒
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