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酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白组学分析

作　者: 胡菲菲
导　师: 华兆哲
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: D-柠檬烯胁迫定量PCR 二维电泳 MALDI-TOF/TOF
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

D-柠檬烯是种常见单萜，它具有萜类典型的分子结构，而且涉及到的代谢途径简单，因此在科研领域中受到广泛研究。D-柠檬烯的芳香气味及天然抑菌性，在食品防腐、农药开发等多方面具有应用价值。然而，D-柠檬烯的抑菌性在些实际应用中却成为限制因素：如利用微生物生产D-柠檬烯时，D-柠檬烯对工程菌的毒害会严重影响其产量；利用柑橘废弃物发酵生产乙醇时，发酵前去除柠檬烯的前处理过程，既增加了生产成本又降低了生产效率。因此，提高微生物对D-柠檬烯耐受性的研究具有重要意义，而此研究的基础是了解微生物对D-柠檬烯的耐受机制。Saccharomyces cerevisiae是目前研究较为透彻的真核模式菌株，作为工程菌可用于合成多种天然产物。本文以S. cerevisiae CEN.PK2为对象，研究了D-柠檬烯胁迫对S.cerevisiae生理活动的影响，以期提高S. cerevisiae对D-柠檬烯的耐受性。ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters，ABC转运蛋白)能够对多种物质进行转运，并排除相关生物毒素，起到了保护细胞的作用。S. cerevisiae细胞膜上的ABC转运蛋白Yor1p、Set6p、Pdr12p、Pdr5p、Snq2p、Aus1p、Pdr15p、Pdr11p及Pdr10p等是细胞抵御外界毒素的第道防线，能够识别并转运多种物质，包括很多萜类及D-柠檬烯类似物。为了研究D-柠檬烯对S. cerevisiae CEN.PK2的影响机制，本文首先通过分析不同浓度D-柠檬烯对S. cerevisiae生长情况的影响，得到D-柠檬烯对S. cerevisiaeCEN.PK2的致死浓度。同时，结合葡萄糖的消耗情况，比较了不同浓度D-柠檬烯胁迫下的细胞得率，得到最适D-柠檬烯胁迫浓度为85mg/L。利用定量PCR技术分析了S.cerevisiae CEN.PK2在85mg/L D-柠檬烯的胁迫下，以上9个细胞膜ABC转运蛋白基因及2个关键调控蛋白(Pdr1p、Pdr3p)基因在转录水平上的变化。定量PCR实验结果表明，只有PDR5、PDR15及YOR1经D-柠檬烯胁迫后表达量上调。将这些基因分别在S.cerevisiae CEN.PK2中过量表达，比较过量表达ABC转运蛋白基因对D-柠檬烯耐受性的影响。结果表明，ABC转运蛋白对提高S. cerevisiae CEN.PK2的D-柠檬烯耐受性无明显帮助。为了进步阐明S. cerevisiae耐受D-柠檬烯的生理机制，应用基于二维电泳和MALDI-TOF/TOF的蛋白质组学技术，分析S. cerevisiae CEN.PK2在85mg/L D-柠檬烯胁迫2h前后蛋白组的变化情况。在蛋白图谱分析的基础上，利用质谱技术，鉴定得到74个差异点，对应56种不同蛋白。对这56种不同蛋白进行GO (Gene Ontology)聚类分析，得知D-柠檬烯可影响S. cerevisiae细胞胁迫响应、糖类代谢呼吸作用、氨基酸及脂类等小分子代谢、细胞结构、核酸代谢及蛋白质代谢等生物过程。对这些生物过程进步分析，得出D-柠檬烯对S. cerevisiae影响的三个重要的推论：(1) S. cerevisiae CEN.PK2在D-柠檬烯胁迫下，对能量需求增加，出现葡萄糖饥饿的假象；(2) D-柠檬烯胁迫下，S. cerevisiae细胞中具有DNA修复功能的Rpt4p及调控细胞增殖分裂功能的Cpr1p下调，从而直接导致细胞增殖受到抑制；(3) D-柠檬烯直接破坏S. cerevisiae细胞膜结构，导致细胞膜脂筏受损。其中葡萄糖饥饿的假象为S. cerevisiae为应对D-柠檬烯胁迫，自身作出的调节反映。后两者为D-柠檬烯毒害S. cerevisiae细胞的重要机制。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-6
目录  6-8
第一章绪论  8-16
  1.1 以 D-柠檬烯为代表的萜类概述  8-9
  1.2 利用 S. cerevisiae 生产 D-柠檬烯的可行性及限制因素  9-11
  1.3 D-柠檬烯对柑橘废弃物利用的限制  11
  1.4 细胞 ABC 转运蛋白对天然产物的影响  11-12
  1.5 蛋白组学研究意义  12-13
  1.6 立题意义  13-14
  1.7 本论文主要研究内容  14-16
第二章材料与方法  16-22
  2.1 菌种与质粒  16
  2.2 培养方法  16-17
    2.2.1 培养基  16
    2.2.2 不同实验中 S. cerevisiae CEN.PK2 的培养  16-17
  2.3 菌体浓度与发酵液葡萄糖浓度分析方法  17
  2.4 分子生物学实验方法  17-19
    2.4.1 定量 PCR 分析  17
    2.4.2 表达载体及过量表达菌株的构建  17-19
  2.5 蛋白组学实验方法  19-22
    2.5.1 二维电泳实验  19-20
    2.5.2 MALDI-TOF/TOF 质谱鉴定蛋白实验  20-21
    2.5.3 关键蛋白基因的定量 PCR 验证  21-22
第三章结果与讨论  22-44
  3.1 S. cerevisiae CEN.PK2 质膜 ABC 转运蛋白对 D-柠檬烯耐受性的影响  22-28
    3.1.1 D-柠檬烯胁迫对 S. cerevisiae CEN.PK2 生长的影响  22-23
    3.1.2 D-柠檬烯胁迫后 ABC 转运蛋白基因转录变化  23-24
    3.1.3 关键 ABC 转运蛋白基因过量表达菌株的构建  24-26
    3.1.4 过量表达 ABC 基因对 S. cerevisiae CEN.PK2 D-柠檬烯耐受性的影响  26-28
  3.2 D-柠檬烯胁迫下 S. cerevisiae CEN.PK2 的蛋白质组学研究  28-34
    3.2.1 不同时间 D-柠檬烯胁迫对 S. cerevisiae CEN.PK2 蛋白表达的影响  28-29
    3.2.2 D-柠檬烯胁迫前后 S. cerevisiae CEN.PK2 易溶蛋白二维电泳图谱分析结果  29-32
    3.2.3 D-柠檬烯胁迫前后 S. cerevisiae CEN.PK2 膜蛋白二维电泳图谱分析结果  32-34
  3.3 D-柠檬烯胁迫对 S. cerevisiae CEN.PK2 蛋白组学研究结果的分析  34-44
    3.3.1 胁迫响应相关差异蛋白的分析  36-37
    3.3.2 能量代谢相关差异蛋白的分析  37-38
    3.3.3 氨基酸代谢相关差异蛋白的分析  38-40
    3.3.4 核酸、蛋白及细胞分裂相关差异蛋白的分析  40-41
    3.3.5 生物膜合成及功能相关差异蛋白的分析  41-42
    3.3.6 关键差异蛋白的定量 PCR 验证  42-44
主要结论与展望  44-46
  主要结论  44
  展望  44-46
致谢  46-48
参考文献  48-54
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  54

酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白组学分析

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