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埃切假丝酵母产香机理及其对酱油风味的影响

作　者: 冯杰
导　师: 詹晓北
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酱油埃切假丝酵母发酵主成分分析流式细胞仪固相微萃取-气相/质谱联用
分类号: TS264.21
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

在酱油的高盐稀态发酵过程中，一般通过添加增香酵母菌来改善酱油的风味，提高酱油品质。目前，虽然已知道酵母菌对酱油酿造过程中风味物质的形成起到重要的作用，但是由于其形成过程非常缓慢，目前相关的研究甚少。考虑到了解酱油风味物质的种类及其产生机制对于如何有效利用增香酵母菌，从而改善酱油风味和提高酱油质量至关重要。本论文以一株耐高盐增香酵母菌埃切假丝酵母菌(Candida etchellsii CICIM Y0600)为研究对象，首先对其生长和代谢情况进行了解析，其次对其在酱油中的增香作用进行了系统性的研究，主要研究内容总结如下：(1)以中国传统的酿造酱油为研究基础，建立了酱油风味质量评价体系模型。首先，利用顶空固相微萃取与气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC/MS)测定了6种酱油中的39种重要挥发性风味物质成分，再通过高效液相色谱(HPLC)法对酱油中的有机酸和游离氨基酸进行分析，并以主成分分析法为基础建立了酱油风味质量的评价模型，最后通过感官评价法对模型评价结果进行了检验，结果表明两种方法具有很好的一致性，表明该文提出的酱油风味质量评价体系方法是可行的，为酱油风味质量的评价探索了一条新的途径。(2)以一株新型耐高盐增香酵母菌为研究基础，对其进行分子生物学鉴定和代谢特性分析。首先，通过ITS核苷酸序列鉴定方法，将序列提交到NCBI-BLAST上进行比对，鉴定该菌株为Candida etchellsii。又通过HPLC法和SPME-GC/MS法对该菌株代谢产生的有机酸，氨基酸和挥发性风味物质进行分析，得出该菌株在72h时分别产酒石酸(0.979±0.040) g/L，甲酸(0.636±0.030) g/L，乳酸(2.80±0.10) g/L，α-酮戊二酸(0.132±0.015)g/L，柠檬酸(2.59±0.10) g/L，琥珀酸(3.03±0.20) g/L；产游离和酸解氨基酸总量分别为(3.7355±0.0027) g/L和(11.5604±0.0037) g/L；主要产4-乙基愈创木酚等典型挥发性风味物质。(3)建立了流式细胞仪检测C. etchellsii细胞活性的方法，并在2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(简称HEMF，酱油中一种典型的重要风味化合物)合成过程中得到应用。应用此方法可以快速准确观察C. etchellsii的生长特征。利用FCM-PI染色法对C.etchellsii在摇瓶中的生长情况进行跟踪。其次，利用化学计量学研究了C. etchellsii合成HEMF的含量分别与菌体浓度，菌体活性和氯化钠浓度的关系。最后，在C. etchellsii发酵过程中，通过盐度调控和氨基酸添加，强化了目标产物HEMF的合成效率。分阶段调控发酵体系的盐度(初始阶段控制氯化钠浓度为200g/L，发酵40h后提升至220g/L)，结合氨基酸添加(向发酵体系中添加丙氨酸、精氨酸和甘氨酸各1.67g/L)。摇瓶结果表明：C. etchellsii合成HEMF的产量为110.74mg/L。7L发酵罐上罐验证，HEMF产量达到121.51mg/L。分阶段盐度调控结合氨基酸添加策略显著强化了C. etchellsii对HEMF的合成。(4)为了提高增香酵母菌在酱醪中的适应性，通过逐步提高氯化钠浓度的方法对C.etchellsii的耐盐度进行驯化培养。通过分析表明，经过5个批次的驯化，C. etchellsii的耐氯化钠浓度由180g/L提高到240g/L。对驯化后的三株耐不同氯化钠浓度的增香酵母菌株进行生物特性研究。结果表明，在200g/L氯化钠浓度的培养基中，C. etchellsii产游离氨基酸和酸解氨基酸总量分别达到2.01g/L和7.00g/L。和其他不同氯化钠浓度条件下比较，其产挥发性酯类物质含量最高，为0.80g/L。最后，将经过驯化的耐4个盐度的菌株接入生酱油中，初始菌浓约为10g/L，经过60天的跟踪分析得出，在200g/L氯化钠浓度条件下酱油中的游离和酸解氨基酸分别比对照提高5.14%和9.71%。在有酵母菌添加的酱油中，其产挥发性风味化合物的种类数更多，关键风味化合物如HEMF、HDMF和4-乙基愈创木酚等物质的含量也明显提高，显著改善了酱油的风味品质。(5)采用两阶段添加法研究C. etchellsii对酱油风味质量的促进。C. etchellsii的添加对于酱油的质量和风味具有重要的促进作用，其中确定了两阶段添加策略来改进酱油的风味，即在发酵30天时添加5%浓度的对数期酵母菌发酵液，在发酵60天时添加20%浓度的成熟期酵母菌发酵液更有利于酱油的质量和风味的提高。结果表明，氨基态氮和可溶性无盐固形物含量分别达到(9.15±0.12) g/L和(269.60±3.15) g/L，比较于对照分别增加了23.1%和17.6%。样品中最高的游离氨基酸含量和39种挥发性风味化合物总量分别达到(58.21±1.77) g/L和(17.81±0.45) g/L，比较于对照分别提高了1.76%和178.7%。C.etchellsii的添加使得酱油中的典型风味物质，如4-乙基愈创木酚和HEMF等物质均有所增加，更好的促进了酱油风味质量的改善和提高。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章绪论  11-37
  1.1 引言  11-12
  1.2 酱油生产的历史与现状  12-19
    1.2.1 中国酱油生产的历史  12-13
    1.2.2 中国酱油生产的现状  13-17
    1.2.3 日本酱油的发展  17-19
  1.3 酱油风味物质研究进展  19-29
    1.3.1 风味物质的定义  20
    1.3.2 酱油中的风味物质  20-22
    1.3.3 影响酱油风味的因素  22-23
    1.3.4 酱油风味物质的提取技术  23-24
    1.3.5 酱油风味物质的定性和定量分析方法  24-26
    1.3.6 国内酱油风味物质研究进展  26-27
    1.3.7 国外酱油风味物质研究进展  27-28
    1.3.8 酱油风味研究中存在的困难及其产生原因  28-29
  1.4 酱油中增香酵母菌研究进展  29-34
    1.4.1 酱油酿造用增香酵母菌  30-33
    1.4.2 增香酵母菌对酱油风味影响的研究  33-34
  1.5 本论文的主要研究内容  34-37
    1.5.1 目前存在的问题  34-35
    1.5.2 本论文研究内容  35-37
第二章一种新的酱油风味质量评价体系模型的建立  37-53
  2.1 引言  37-38
  2.2 材料与方法  38-39
    2.2.1 材料  38
    2.2.2 分析方法  38-39
    2.2.3 综合评价模型的建立  39
    2.2.4 感官评定  39
  2.3 结果与讨论  39-52
    2.3.1 不同酱油样品的常规理化指标  39-40
    2.3.2 不同酱油样品香气组成测定结果  40-44
    2.3.3 不同酱油样品挥发性风味物质主成分分析及其评价结果  44-47
    2.3.4 不同酱油样品游离氨基酸和有机酸评价结果  47-49
    2.3.5 挥发性风味物质、游离氨基酸和有机酸的综合评价结果  49-50
    2.3.6 模型的检验  50-52
  2.4 本章小结  52-53
第三章耐高盐增香酵母菌的鉴定及其代谢特征解析  53-63
  3.1 引言  53
  3.2 材料与方法  53-55
    3.2.1 菌株  53
    3.2.2 培养基  53-54
    3.2.3 实验设备  54
    3.2.4 分析方法  54-55
  3.3 结果与讨论  55-61
    3.3.1 耐高盐增香酵母菌的鉴定  55-56
    3.3.2 C. etchellsii生物特性指标分析  56-58
    3.3.3 C. etchellsii产有机酸分析  58-59
    3.3.4 C. etchellsii产氨基酸分析  59-60
    3.3.5 C. etchellsii产挥发性风味物质分析  60-61
  3.4 本章小结  61-63
第四章高渗透压胁迫下Candida etchellsii合成HEMF优化研究  63-75
  4.1 引言  63-66
  4.2 材料与方法  66-67
    4.2.1 菌种  66
    4.2.2 培养基  66
    4.2.3 实验设备  66
    4.2.4 分析方法  66
    4.2.5 流式细胞分析  66-67
  4.3 结果与讨论  67-74
    4.3.1 流式细胞仪测定细胞活性标准的建立与检验  67-68
    4.3.2 发酵过程中细胞活性的变化  68
    4.3.3 发酵过程中HEMF产量和生物量及细胞活性变化  68
    4.3.4 C. etchellsii合成HEMF与细胞及盐浓度的相关性分析  68-70
    4.3.5 不同氯化钠浓度对C. etchellsii合成HEMF影响  70-71
    4.3.6 添加不同氨基酸对C. etchellsii合成HEMF影响  71-73
    4.3.7 氯化钠分阶段调控结合氨基酸添加对C. etchellsii合成HEMF影响  73
    4.3.8 7 L发酵罐验证两种添加策略对C. etchellsii合成HEMF影响  73-74
  4.4 本章小结  74-75
第五章 Candida etchellsii耐盐度驯育及其在酱油中的作用研究  75-87
  5.1 引言  75
  5.2 材料与方法  75-76
    5.2.1 菌株  75-76
    5.2.2 培养基  76
    5.2.3 分析方法  76
  5.3 结果与讨论  76-86
    5.3.1 耐不同氯化钠浓度的C. etchellsii驯化  76-79
    5.3.2 不同氯化钠浓度对C. etchellsii生长和产酯香影响  79-80
    5.3.3 不同氯化钠浓度对C. etchellsii产氨基酸影响  80-82
    5.3.4 不同氯化钠浓度下C. etchellsii在酱油中的代谢和自溶分析  82-83
    5.3.5 不同氯化钠浓度下C. etchellsii在酱油中产氨基酸分析  83-84
    5.3.6 不同氯化钠浓度下C. etchellsii在酱油中产挥发性风味物质分析  84-86
  5.4 本章小结  86-87
第六章基于Candida etchellsii两阶段添加策略促进对酱油风味质量的改善  87-103
  6.1 引言  87
  6.2 材料与方法  87-88
    6.2.1 菌株  87
    6.2.2 培养基  87
    6.2.3 分析方法  87-88
  6.3 结果与讨论  88-100
    6.3.1 C. etchellsii的生长曲线和在酱油中的代谢和自溶曲线  88-90
    6.3.2 单点添加对数期和成熟期C. etchellsii对生酱油常规理化指标影响  90-92
    6.3.3 两阶段添加C. etchellsii对生酱油常规理化指标影响  92
    6.3.4 两阶段添加C. etchellsii对生酱油有机酸和游离氨基酸指标影响  92-97
    6.3.5 两阶段添加发酵液对生酱油挥发性风味化合物指标的影响  97-100
    6.3.6 综合评价模型对酱油产品的检验  100
  6.4 本章小结  100-103
结论  103-105
论文创新点  105-107
致谢  107-109
参考文献  109-123
附录Ⅰ作者在攻读博士学位期间发表的论文  123-125
附录Ⅱ英文缩写与中文名称对照  125

埃切假丝酵母产香机理及其对酱油风味的影响

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