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泽泻α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其活性研究

作　者: 尹红梅
导　师: 易醒
学　校: 南昌大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 泽泻 α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型 α-淀粉酶葡萄糖吸收
分类号: TS201
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文以江西省资源丰富的泽泻Alisma orientalis (Sam.) Juzep.为研究对象,旨在进行泽泻α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其活性研究。研究工作由5部分组成：1.对经典的pNPG法进行改良,以小鼠小肠α-葡萄糖苷酶为反应酶,固定反应温度37℃、pH6.8,建立体外α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型。该模型的优化条件为：反应时间10min,酶液添加量20μL,底物添加量20μL。在此条件下,酶活力平均值为85.6U。二甲基亚砜的终浓度宜控制在0.4%以下。筛选结果显示,泽泻正丁醇部分体外具有较强的小鼠小肠α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC50为126μg/mL,阿卡波糖(阳性对照)IC50为251μg/mL。2.采用硅胶柱层析法对泽泻正丁醇部分进行分离,得到六组分(Fr.1, Fr.2, Fr.3, Fr.4, Fr.5, Fr.6),应用体外α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型对六组分进行活性筛选,结果显示Fr.1体外酶抑制活性最高为66.1%,高于阿卡波糖的抑制活性(51.4%),泽泻正丁醇部分的抑制率为56.30%。3.应用GC/MS分析泽泻正丁醇部分的化学组成。结果总共确认了23个化合物,其中以N,N-二甲基-1,3-二氨基丙烷的含量为最高,分析出萜类物质：α-萜品烯、4-萜烯醇、萜品油烯。4.以阿卡波糖为阳性对照,考察浓度为0.002-20.000mg/mL的泽泻正丁醇部分对小鼠蔗糖酶、麦芽糖酶和猪胰腺α-淀粉酶抑制活性。结果表明：随着样品浓度的增加,离体小鼠小肠蔗糖酶和麦芽糖酶的酶活随之降低,抑制作用呈现一定剂量依赖性。泽泻正丁醇部分的IC50分别为0.862mg/mL(蔗糖酶)、0.522mg/mL(麦芽糖酶),阿卡波糖的IC50分别为0.113mg/mL(蔗糖酶)、10.521mg/mL(麦芽糖酶)。泽泻正丁醇部分对猪胰腺α-淀粉酶的抑制活性很小(2.31%以下),而阿卡波糖表现出极强的α-淀粉酶抑制活性,抑制作用呈现剂量依赖性,最高抑制率为98.59%。昆明小鼠连续灌胃10天后,泽泻正丁醇部分和阿卡波糖都能有效抑制小鼠小肠蔗糖酶和麦芽糖酶活性。和生理盐水组比较,泽泻正丁醇部分(P<0.05)能显著的抑制小鼠小肠蔗糖酶活性。5.利用大鼠离体小肠囊模型,考察泽泻正丁醇部分及其分离组分对离体小肠葡萄糖吸收的影响。结果表明终浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000mg/mL的泽泻正丁醇部分对离体小肠葡萄糖吸收的抑制作用高于阿卡波糖的最佳抑制作用,但是抑制率和样品浓度不呈现相关性。泽泻正丁醇部分及其分离组分对离体小肠葡萄糖吸收的抑制活性大小为,泽泻正丁醇部分最大,Fr.1次之。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第1章概述  12-28
  1.1 天然产物治疗糖尿病的研究进展  12-15
    1.1.1 抗糖尿病天然产物活性成分  13-14
    1.1.2 天然产物治疗糖尿病的作用机制  14-15
  1.2 α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展  15-23
    1.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制剂的种类  15-17
    1.2.2 植物α-葡萄糖苷酶抑制剂  17-21
    1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用机理  21
    1.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法  21-23
  1.3 泽泻的研究进展  23-26
    1.3.1 泽泻的化学成分研究  23-24
    1.3.2 泽泻的药理作用  24-26
  1.4 主要研究内容和创新点及科学意义  26-28
    1.4.1 主要研究内容和创新点  26
    1.4.2 科学意义  26-28
第2章体外α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型的建立及其应用  28-38
  2.1 引言  28
  2.2 实验材料和仪器  28-29
    2.2.1 实验材料  28-29
    2.2.2 实验动物  29
    2.2.3 仪器与设备  29
  2.3 实验方法  29-31
    2.3.1 试剂的配制  29
    2.3.2 泽泻提取物的制备  29
    2.3.3 鼠源α-葡萄糖苷酶的提取  29-30
    2.3.4 pNP的标准曲线的绘制  30
    2.3.5 鼠源α-葡萄糖苷酶抑制剂微量筛选模型的条件优化  30-31
    2.3.6 泽泻正丁醇部分对鼠源α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定  31
  2.4 结果与讨论  31-36
    2.4.1 pNP标准曲线  31-32
    2.4.2 鼠源α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的影响因素  32-34
    2.4.3 微量筛选模型的条件优化  34-35
    2.4.4 二甲基亚砜对酶反应的影响  35
    2.4.5 泽泻正丁醇部分抑制鼠源α-葡萄糖苷酶活性  35-36
  2.5 本章小结  36-38
第3章泽泻提取物化学成分的分析  38-45
  3.1 引言  38
  3.2 实验材料和仪器  38-39
    3.2.1 实验材料  38
    3.2.2 仪器与设备  38-39
  3.3 实验方法  39-40
    3.3.1 泽泻正丁醇部分的硅胶柱层析分离  39
    3.3.2 泽泻分离组分的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选  39
    3.3.3 泽泻分离组分的紫外扫描  39
    3.3.4 泽泻正丁醇部分的GC/MS分析  39-40
  3.4 结果与讨论  40-43
    3.4.1 泽泻正丁醇部分分离组分的体外筛选结果  40-41
    3.4.2 泽泻正丁醇部分和Fr.1的紫外扫描结果  41
    3.4.3 泽泻正丁醇部分的GC/MS分析  41-43
  3.5 本章小结  43-45
第4章泽泻正丁醇部分抑制小鼠小肠α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性  45-59
  4.1 引言  45
  4.2 实验材料和仪器  45-46
    4.2.1 实验材料  45-46
    4.2.2 实验动物  46
    4.2.3 实验仪器  46
  4.3 实验方法  46-50
    4.3.1 葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖含量的原理  46
    4.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制  46-47
    4.3.3 鼠源α-葡萄糖苷酶蛋白质总量的测定(Bradford法)  47
    4.3.4 泽泻正丁醇部分对小鼠小肠蔗糖酶活性的抑制作用实验  47
    4.3.5 泽泻正丁醇部分对小鼠小肠麦芽糖酶活性抑制作用实验  47-48
    4.3.6 泽泻正丁醇部分对猪胰腺α-淀粉酶的抑制作用实验  48-49
    4.3.7 酶活定义  49
    4.3.8 连续灌胃泽泻正丁醇部分对小鼠小肠酶活性的影响  49-50
  4.4 结果和讨论  50-57
    4.4.1 葡萄糖标准曲线  50-51
    4.4.2 BSA标准曲线  51-52
    4.4.3 泽泻正丁醇部分对小鼠小肠蔗糖酶活性的抑制作用  52-53
    4.4.4 泽泻正丁醇部分对小鼠小肠麦芽糖酶活性的抑制作用  53
    4.4.5 泽泻正丁醇部分对猪胰腺α-淀粉酶的抑制作用  53-54
    4.4.6 连续灌胃泽泻正丁醇部分对小鼠小肠α-葡萄糖苷酶活性的影响  54-55
    4.4.7 连续灌胃泽泻正丁醇部分对小鼠体内蔗糖酶活性的影响  55-56
    4.4.8 连续灌胃泽泻正丁醇部分对小鼠体内麦芽糖酶活性的影响  56-57
  4.5 本章小结  57-59
第5章泽泻正丁醇部分及其分离组分对离体小肠葡萄糖吸收的影响  59-69
  5.1 引言  59
  5.2 实验材料和仪器  59-60
    5.2.1 实验材料  59
    5.2.2 仪器  59-60
  5.3 实验方法  60-62
    5.3.1 大鼠离体肠营养液的制备  60
    5.3.2 翻转离体小肠囊的制备  60
    5.3.3 反应体系的优化  60-61
    5.3.4 泽泻正丁醇部分对离体小肠葡萄糖转运的影响  61
    5.3.5 泽泻正丁醇部分对离体小肠葡萄糖吸收的影响  61-62
    5.3.6 泽泻正丁醇部分的分离组分对离体小肠葡萄糖吸收的影响  62
  5.4 结果和讨论  62-67
    5.4.1 离体小肠囊反应体系中最适底物浓度的确定  62-63
    5.4.2 离体小肠囊反应体系中最适反应时间的确定  63-64
    5.4.3 离体小肠囊反应体系中阳性对照药物最佳浓度的确定  64
    5.4.4 泽泻正丁醇部分对离体小肠葡萄糖转运的影响  64-65
    5.4.5 泽泻正丁醇部分对离体小肠葡萄糖吸收的影响  65-66
    5.4.6 泽泻正丁醇部分的分离组分对离体小肠葡萄糖吸收的影响  66-67
  5.5 本章小结  67-69
第6章结论与展望  69-71
  6.1 结论  69-70
  6.2 展望  70-71
致谢  71-72
参考文献  72-78
攻读学位期间的研究成果  78

泽泻α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选及其活性研究

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